MiR-21調(diào)控肝星狀細(xì)胞生物學(xué)活性研究.pdf

1、[研究背景及目的]：
　　 肝纖維化是慢性肝損傷進(jìn)展至肝硬化的重要階段，以細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)過度沉積為主要病理特征。盡管肝臟中許多類型的細(xì)胞如肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞等都參與了肝纖維化過程，但肝星狀細(xì)胞(hepaticstellatecells，HSCs)是產(chǎn)生ECM的最主要細(xì)胞。當(dāng)發(fā)生肝損傷時(shí)，HSC活化并分化為成纖維樣細(xì)胞，進(jìn)而表達(dá)α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smoothmuscleactin，α

2、-SMA)、分泌促纖維生成ECM。因此，控制HSC的活性可為肝纖維化的治療提供新的靶點(diǎn)。
　　 微小RNA(microRNA，miRNA)是一類約有21-25個(gè)堿基的非編碼小RNA，它通過完全或不完全結(jié)合于靶序列的3’UTR端，降解靶基因mRNA或抑制其翻譯，對(duì)基因表達(dá)發(fā)揮調(diào)控作用。近年來，大量研究表明：miR-21參與介導(dǎo)了多種器官纖維化的發(fā)生，如肺，肝臟，心臟等。我們的前期初步研究發(fā)現(xiàn)，miR-21是與HSC活化相關(guān)的miR

3、NA，對(duì)于肝纖維化發(fā)病機(jī)制研究和臨床治療具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
　　 本文旨在探討miR-21對(duì)HSC活化和生物學(xué)活性的調(diào)控作用及其機(jī)制。
　　 [實(shí)驗(yàn)方法]：
　　 一、檢測(cè)不同活化狀態(tài)大鼠HSC和HSC-T6miR-21及相關(guān)基因差異表達(dá)
　　 膠原酶改良原位循環(huán)灌流法分離雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠原代HSC，分設(shè)三組：靜息狀態(tài)組即原代培養(yǎng)2天；TGFβ(2ng/ml)刺激3天組；TG

4、Fβ刺激7天組。realtimeRT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞miR-21及纖維化相關(guān)基因組織金屬蛋白酶抑制-1(tissueinhibitorofmetalloproteinase-1，TIMP-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶類(matrixmetalloproteinases，MMPs)、α-SMA及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellularsignal-regulatedkinase，ERK)、SPRY2的表達(dá)。
　　 二、檢測(cè)正常

5、大鼠及肝纖維化模型肝臟組織及血清miR-21差異表達(dá)
　　 將雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組，每組7只。第1組為正常對(duì)照組，第2～4組為實(shí)驗(yàn)組，分別為二甲基亞硝胺(DMN)注射1周組、2周組和4周組。2～4組予1％DMN100ul/100g體重腹腔注射，每周連續(xù)注射3次，分別于注射1周、2周、4周處死大鼠，留取大鼠靜脈血及肝臟組織；HE、MASSON、VG染色檢測(cè)ECM含量并對(duì)肝纖維化程度分級(jí)，圖像分析儀半定量分析；realtimeR

6、T-PCR檢測(cè)肝臟組織及血清中miR-21的表達(dá)；realtimeRT-PCR測(cè)定肝組織TIMP-1、MMPs、α-SMA、ERK、SPRY2的表達(dá)。
　　 三、下調(diào)miR-21表達(dá)對(duì)HSC-T6細(xì)胞生物學(xué)特性的影響
　　 用lipofectamine2000將miR-21inhibitor轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞，6小時(shí)換液，48小時(shí)后Trizol法抽提miRNA，realtimeRT-PCR鑒定miR-21表達(dá)；CCK-

7、8檢測(cè)HSC-T6細(xì)胞的增殖情況；realtimeRT-PCR肝纖維化相關(guān)基因α-SMA、TIMP-1及MMPs等mRNA和蛋白表達(dá)變化；
　　 四、下調(diào)miR-21表達(dá)對(duì)HSC-T6ERK信號(hào)通路的調(diào)控作用
　　 用lipofectamine2000將miR-21inhibitor轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞，6小時(shí)換液，48小時(shí)后抽提蛋白和總RNA，westernblot法檢測(cè)miR-21調(diào)控靶蛋白SPRY2表達(dá)；realt

8、imeRT-PCR和westernblot法檢測(cè)ERK通路相關(guān)基因p-ERK1/2、ERK1/2、RSK2的表達(dá)；細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)ERK通路相關(guān)基因ERK1、RSK2、SPRY2的表達(dá)。
　　 五、驗(yàn)證miR-21對(duì)SPRY23'-UTR的靶向調(diào)控作用
　　 設(shè)計(jì)SPRY23'-UTR報(bào)告基因質(zhì)粒，同時(shí)合成miR-21寡核苷酸片段miR-21mimic，將miR-21mimic與SPRY2報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-29

9、3細(xì)胞，證實(shí)SPRY2為miR-21的靶基因。
　　 六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 數(shù)據(jù)采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，結(jié)果以X-±S表示。P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 [實(shí)驗(yàn)結(jié)果]：
　　 一、miR-21表達(dá)隨HSC活化逐步上調(diào)
　　 realtimeRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著原代HSC的不斷活化，miR-21表達(dá)逐步上調(diào)(P<0.05)；TIMP-1、α-SMA、ERK1表達(dá)上調(diào)

10、，MMPs表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。
　　 二、miR-21在DMN大鼠肝纖維化模型肝組織和血清中含量升高
　　 realtimeRT-PCR法檢測(cè)表明，肝纖維化組與正常組相比，肝組織和血清中miR-21表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)；肝纖維化組肝臟組織中TIMP-1、α-SMA和ERK1mRNA表達(dá)上調(diào)，MMPs、SPRY2表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)。
　　 三、下調(diào)miR-21表達(dá)可降低HSC-T6細(xì)胞生物學(xué)

11、活性
　　 miR-21inhibitor轉(zhuǎn)染HSC-T6后，realtimeRT-PCR法檢測(cè)miR-21表達(dá)下調(diào)約80％(P<0.05)，轉(zhuǎn)染第2天，CCK-8檢測(cè)HSC-T6細(xì)胞增殖能力降低24.5％，第3天降低27％(P<0.05)；realtimeRT-PCR法檢測(cè)纖維化相關(guān)基因Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TGFβ、α-SMAmRNA表達(dá)分別降低56％、48％、40％和45％，MMP9表達(dá)增加39％，MMP13表達(dá)明顯增多(P

12、<0.05)。
　　 四、下調(diào)miR－21表達(dá)可降低HSC－T6ERK通路活性
　　 miR－21inhibitor轉(zhuǎn)染HSC－T6后，ERK1、RSK2mRNA水平表達(dá)分別下調(diào)35％和36％(P<0.05)，westernblot法檢測(cè)P－ERK1/2、RSK2表達(dá)明顯減少，SPRY2表達(dá)明顯增加；細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，ERK1與α-SMA在HSC－T6胞質(zhì)中含量顯著降低，SPRY2含量明顯增加。
　　 五、報(bào)

13、告基因測(cè)定證實(shí)上調(diào)miR-21表達(dá)可降低SPRY2熒光素酶活性
　　 miR－21mimic與SPRY23’UTR報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK－293細(xì)胞，結(jié)果顯示miR-21表達(dá)上調(diào)后，SPRY2報(bào)告基因質(zhì)粒熒光素酶活性降低。
　　 [結(jié)論]：
　　 一、miR－21在活化HSC、肝纖維化模型肝組織、血清中表達(dá)上調(diào)。
　　 二、體外下調(diào)miR－21表達(dá)可降低HSC－T6細(xì)胞的生物學(xué)活性。
　　 三、