miR-21與PTEN靶向調(diào)控作用對腎母細胞瘤生物學行為的影響及作用機制的研究.pdf

1、研究背景和目的
　　腎母細胞瘤（Wilms' tumor，WT）是兒科最為常見的原發(fā)于腎臟的泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計，WT占所有兒科腫瘤的6％，其在小于15歲的兒童及青少年中綜合發(fā)病率約為0.1‰。WT平均診斷年齡為36個月，大于10歲或小于6月齡的病例較為少見。腎母細胞瘤的發(fā)病原因尚未完全了解，目前認為，其可能起源于異常增生的、未正常分化形成腎單位的后腎胚基。腎母細胞瘤的組織學分類包括上皮型、胚芽型、間葉型及混合型四類;每一

2、類又可根據(jù)是否含有間變細胞而分為預后好的組織結(jié)構(gòu)（不含間變細胞，F(xiàn)H）及預后差的組織結(jié)構(gòu)（可檢出間變細胞，UH）。腎母細胞瘤的臨床表現(xiàn)缺乏特異性，主要包括:無癥狀腹部腫塊、血尿、腹痛、高血壓，及腫瘤壓迫癥狀等，并可伴發(fā)多種先天畸形，如WAGR綜合征、BWS綜合征、DDS綜合征等。
　　腫瘤的發(fā)生涉及多個基因的表達異常，是多因素、多階段及體內(nèi)外多種因素共同作用的復雜過程，并可能與遺傳因素有關(guān)。而惡性腫瘤發(fā)生和演進過程中的一個重要特征

3、，就是癌基因的激活或過表達與抑癌基因的缺失或表達抑制。同時，腎母細胞瘤是公認的應(yīng)用現(xiàn)代綜合療法效果最好的小兒惡性實體腫瘤之一，目前腎母細胞瘤的治療趨勢是，在盡量保持并不斷提高現(xiàn)有生存率的基礎(chǔ)上盡可能減少治療強度，以降低治療相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生率，最終降低病死率。因此，明確的診斷和分期，確切的病理分型，個體化的綜合治療，尋找敏感的分子生物學指標以指導治療和隨訪，是改善腎母細胞瘤患兒預后，提高生存率的重要手段。
　　微小RNA(micro

4、RNAs，miRNAs)是一類僅含18-25nt的，具有基因表達調(diào)節(jié)功能的非編碼，單鏈短序列RNA。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA的作用幾乎貫穿整個生命活動的全過程，其對細胞增殖、分化、細胞周期調(diào)控和細胞凋亡等方面的作用正日益受到關(guān)注。眾多國內(nèi)外研究成果都證實，miRNA復雜調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的紊亂與細胞增殖和凋亡過程的調(diào)節(jié)失控可能存在一定關(guān)聯(lián)，因此miRNA可作為癌基因或抑癌基因，參與調(diào)控多種惡性腫瘤的發(fā)生和演進等關(guān)鍵階段。
　　作為miRNA中具

5、有代表性的癌基因之一，miR-21在幾乎所有研究過的實體腫瘤組織中均呈高表達，miR-21主要通過與多種抑癌基因mRNA的3'-UTR區(qū)不完全互補配對結(jié)合，使其功能受到抑制，從而發(fā)揮癌基因的作用。目前多種成人腫瘤的研究已經(jīng)證實，miR-21的下游靶基因包括Maspin、PDCD4、PTEN、RECK、Sprouty（包括Spry-1、Spry-2）、TIMP-3、TPM1等，miR-21通過調(diào)控上述抑癌基因，對多種腫瘤細胞的增殖、分化、

6、侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性行為發(fā)揮重要的促進作用。但其在腎母細胞瘤中的表達及作用機理尚無文獻報道。
　　對于“明星”抑癌基因PTEN來說，其獨特的磷酸酶活性可通過多種途徑在細胞的生命活動中發(fā)揮負調(diào)節(jié)作用，拮抗癌基因的作用，維持機體的正常代謝和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。國內(nèi)外大量研究表明，在包括腎母細胞瘤在內(nèi)的多種進展期腫瘤中均可見PTEN的高頻突變或缺失，提示其低表達與腫瘤的發(fā)生、演進及惡性行為關(guān)系密切。
　　對于經(jīng)典的具有癌基因活性的PI3K/A

7、KT信號通路而言，其在多種研經(jīng)究證實的腫瘤細胞中異常激活，對促進腫瘤細胞的惡性增殖和侵襲、抑制凋亡，以及介導腫瘤細胞的化學耐藥和放療抵抗等機制中起著重要作用。而PTEN正是負向調(diào)控這一信號通路起始的關(guān)鍵酶之一，它可以通過一系列磷酸化作用顯著抑制AKT的活化，進一步阻斷AKT調(diào)控的下游信號轉(zhuǎn)導通路，對抗AKT作為癌基因的作用。
　　在多種成人腫瘤的研究中，都提示或證實PTEN是miR-21潛在靶基因之一。因此我們推測，在腎母細胞瘤中

8、，miR-21與PTEN也存在這種靶向調(diào)控關(guān)系，并通過這一靶向調(diào)控關(guān)系，進一步調(diào)控腎母細胞瘤的生物學行為。
　　基于以上理論，本研究的目的是:分析miR-21及PTEN蛋白在小兒腎母細胞瘤組織和瘤旁正常對照組織中的表達差異，探討miR-21和PTEN蛋白的表達與小兒腎母細胞瘤包括性別、年齡、臨床分期、病理組織學類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等在內(nèi)的多種臨床病理參數(shù)及WT患兒預后的關(guān)系，并在此基礎(chǔ)上，通過培養(yǎng)腎母細胞瘤原代細胞，采用miR-21

9、inhibitor抑制miR-21的表達，觀察PTEN及下游PI3k/AKT信號通路蛋白表達，研究PTEN活性的變化，并研究miR-21表達抑制對腎母細胞瘤細胞包括細胞增殖、細胞侵襲及細胞凋亡等在內(nèi)的生物學行為的影響，最終證實WT中兩者的靶向調(diào)控關(guān)系，深入探究miR-21與PTEN參與WT發(fā)生演進的可能機制，以期為WT早期的分子生物學診斷及靶向治療的研究提供一定的理論支持和實驗參考依據(jù)。
　　方法
　　1.miR-21及PT

10、EN在腎母細胞瘤組織中的表達、臨床意義及與預后的相關(guān)性研究:收集89例小兒腎母細胞瘤患者腫瘤組織及30例瘤旁正常腎組織，采用qRT-PCR和蛋白免疫印跡法分別檢測miR-21及PTEN基因和蛋白的表達水平在WT和瘤旁組織中的差異，探討miR-21和PTEN蛋白的表達與小兒腎母細胞瘤包括性別、年齡、臨床分期、病理組織學類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等在內(nèi)的多種臨床病理參數(shù)及WT患兒預后的關(guān)系。兩組之間基因和蛋白表達的差異采用兩獨立樣本t檢驗，蛋白表達水

11、平與腎母細胞瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系統(tǒng)計采用x2檢驗;生存分析方面，應(yīng)用Kaplan-Meier法繪制并分析生存曲線，生存率的結(jié)果應(yīng)用log-rank進行顯著性檢驗，并進行預后的單因素回歸分析;應(yīng)用COX比例風險模型進行預后的多因素回歸分析以探究影響WT患兒預后的獨立危險因素，設(shè)P=0.05為檢驗水準。
　　2.miR-21在腎母細胞瘤原代培養(yǎng)細胞中靶向調(diào)控PTEN機制的研究:采用細胞瞬時轉(zhuǎn)染的方法將miR-21 inhibitor轉(zhuǎn)

12、染經(jīng)實驗證實的miR-21高表達的腎母細胞瘤原代培養(yǎng)細胞，抑制原代細胞中miR-21的表達，利用qRT-PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡法分別檢測原代細胞中miR-21、PTEN mRNA和蛋白水平的變化，并觀察其對PTEN/PI3K/AKT信號通路中關(guān)鍵蛋白表達的影響。隨后利用CCK-8、Transwell小室和流式細胞技術(shù)觀察抑制miR-21對WT原代細胞增殖、侵襲和凋亡等生物學行為的影響。最后，利用雙螢光素酶報告基因?qū)嶒灆z測PTEN-3'-

13、UTR活性變化。各基因及相關(guān)蛋白表達以均數(shù)±標準差形式表示，兩個樣本均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗，多個樣本均數(shù)比較采用ANOVA方差分析，以P=0.05為檢驗水準。
　　結(jié)果
　　1.腎母細胞瘤組織中miR-21、PTEN的表達、臨床意義及與預后的相關(guān)性:與瘤旁對照組織相比，腎母細胞瘤組織中，(1) miR-21的表達顯著上調(diào)，而PTEN蛋白的表達顯著降低，二者表達的差異有統(tǒng)計學意義;(2) miR-21表達上調(diào)與患兒年齡(

14、＞2y)、較高臨床分期、病理組織分型（UH型）及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理因素密切相關(guān)(P＜0.05);PTEN蛋白的下調(diào)與患幾年齡(＞2y)、較高臨床分期、病理組織分型（UH型）等臨床病理因素密切相關(guān)(P＜0.05);(3)直線相關(guān)分析表明，miR-21與PTEN蛋白的表達存在負相關(guān)性(r=-0.687，P＜0.05);(4)病例資料的2y及5y生存情況的單因素生存分析結(jié)果顯示，miR-21高表達和PTEN蛋白的低表達與WT患兒的不良預后

15、密切相關(guān)。多因素方差分析表明，盡管miR-21和PTEN蛋白相對表達量直接與多個臨床病理參數(shù)及患兒預后相關(guān)，但尚不能成為影響WT患兒預后的獨立危險因素。
　　2.miR-21在腎母細胞瘤原代培養(yǎng)細胞中靶向調(diào)控PTEN機制:在WT原代培養(yǎng)細胞中，(1)轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor可明顯抑制miR-21的表達;(2) miR-21抑制后，PTEN蛋白水平增加，而mRNA表達水平變化不明顯，證明miR-21在轉(zhuǎn)錄后水平沉默PTE

16、N表達;(3) miR-21抑制后，PTEN蛋白表達水平增加，其下游的PI3K、p-AKT等信號通路關(guān)鍵分子的蛋白表達水平均降低，證實miR-21通過抑制PTEN，從而正向調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路而發(fā)揮基因調(diào)節(jié)作用;(4)與陰性對照組(NC)和空白對照組(MOCK)比較，轉(zhuǎn)染抑制組(IN)下調(diào)miR-21對明顯抑制WT原代細胞的增殖和侵襲（P＜0.05），顯著增加WT原代培養(yǎng)細胞的凋亡(P＜0.05);(5)雙螢光素酶報告基因?qū)嶒炞C

17、實，IN組能導致野生型PTEN-3'-UTR螢光活性的增加，而NC組不能導致野生型PTEN-3'-UTR螢光活性的增加(P=0.002)，證實PTEN在3'-UTR端受miR-21的直接調(diào)控;IN組中，野生型PTEN-3'-UTR螢光活性與突變型PTEN-3'-UTR相比顯著降低(P=0.002)，證實miR-21靶向調(diào)控PTEN的靶點位于突變位點;IN組和NC組對突變型PTEN-3'-UTR的螢光活性均無影響(P=1.000)，證實P

18、TEN分子3'-UTR端的突變位點作為miR-21的靶位點具有唯一性。
　　結(jié)論
　　1.WT組織中，miR-21表達上調(diào)，PTEN蛋白表達下調(diào)，兩分子的表達水平呈負相關(guān)，并與腎母細胞瘤的惡性程度、侵襲性及不良預后關(guān)系密切，因此miR-21與PTEN分子可作為評價WT惡性程度、預后及輔助制定放化療方案的有價值的分子標志物;
　　2.WT原代培養(yǎng)細胞中，miR-21在轉(zhuǎn)錄后水平靶向負調(diào)控PTEN的表達，并通過PTEN正向