miR-21靶向調(diào)控Jagged-1在心肌纖維化中的作用.pdf

1、目的：
　　基于Notch信號通路篩選出可能調(diào)控心肌纖維化的miRNA，從中選出調(diào)控作用最顯著的miRNA（本研究篩選出miR-21/miRNA-21）。并進(jìn)一步研究miR-21通過靶向調(diào)控Notch信號通路的配體蛋白Jag1(Jagged-1)在心肌纖維化中的作用。
　　方法：
　　1、分離大鼠心肌成纖維細(xì)胞(Cardiacfibroblast,CFB)，原代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)至細(xì)胞最佳狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)分為三組：未加TGF-β

2、1(Transforminggrowthfactor-β1)組、10ng/mlTGF-β1組、10ng/mlTGF-β1+10μMDAPT組。經(jīng)RNA抽提、反轉(zhuǎn)錄與qPCR，篩選調(diào)控心肌纖維化新型miRNA（假定為miRNA-X）。
　　2、在TGF-β1刺激前，轉(zhuǎn)染miRNA-X的抑制劑，通過WB(WesternBlot)檢測TGF-β1刺激下的Vimentin和α-SMA(α-smoothmuscleactin)的表達(dá)情況，明

3、確在TGF-β1刺激下，miRNA-X對心肌成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化(Cardiacfibroblast-myofibroblasttransformation,CMT)的影響作用。
　　3、轉(zhuǎn)染miRNA-X的抑制劑，陰性對照為無義的抑制劑，利用CCK8(cellcountingkit)試劑盒檢測miRNA-X對心肌成纖維細(xì)胞增殖能力的影響，進(jìn)一步篩選出調(diào)控心肌纖維化效果最顯著的miRNA。
　　4、構(gòu)建psiCHEC

4、K-2-Jag13’-UTRWT(Wild-Type)/Muta(Mutation)，將pre-miR-21、對照質(zhì)粒分別與psiCHECK-2-Jag13’-UTRWT、psiCHECK-2-Jag13’-UTRMuta共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，裂解細(xì)胞，檢測熒光素酶的熒光強(qiáng)度，分析miR-21與Jag1的3’-UTR的相互關(guān)系。
　　5、構(gòu)建腺病毒Ad-GFP(Adenovirus-GreenFluorescentProtein)以

5、及Ad-miR-21-sponge(Adenovirus-miR-21-sponge)，分離大鼠心肌成纖維細(xì)胞，原代培養(yǎng)，傳代至細(xì)胞生長穩(wěn)定，分為兩組，分別轉(zhuǎn)染Ad-GFP以及Ad-miR-21-sponge，36h后以TGF-β1處理，提取蛋白，WB檢測Vimentin、DDR2、a-SMA、Tensin的表達(dá)情況。利用CCK8試劑盒檢測miR-21對心肌成纖維細(xì)胞增殖能力的影響，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測心肌成纖維細(xì)胞的遷移能力

6、。WB檢測Jag1蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　TGF-β1刺激CFB細(xì)胞中，miR-21、miR-23b、miR-140表達(dá)量影響比較明顯，其中miR-21可與Jag1的3’-UTR結(jié)合。阻斷miR-21，可顯著抑制心肌成纖維細(xì)胞的增殖能力，并可抑制其遷移能力，逆轉(zhuǎn)TGF-β1刺激下心肌成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。
　　結(jié)論：
　　miR-21通過靶向調(diào)控Notch信號通路的配體蛋白Jag1，抑制心肌成纖維細(xì)胞