miR-21在胃癌發(fā)生及進(jìn)展中作用的分子機(jī)制研究.pdf

1、本研究分為三部分： 第一部分：miR-21在胃癌、胃癌細(xì)胞株、H.pylori感染者及正常人胃粘膜中的表達(dá) 目的：研究胃癌組織、胃癌細(xì)胞株及H.pylori感染者胃粘膜miR-21的表達(dá)水平，評價(jià)其與胃癌及H.pylori感染的相關(guān)性。 方法：胃癌手術(shù)組織標(biāo)本10例，采集自上海仁濟(jì)醫(yī)院消化科病理室，并由病理醫(yī)生獨(dú)立做出診斷12例H.pylori感染胃粘膜組織標(biāo)本及8例正常胃粘膜組織標(biāo)本均采集自上海仁濟(jì)醫(yī)院胃鏡室，

2、并經(jīng)快速尿素酶試驗(yàn)及病理醫(yī)生根據(jù)鏡下組織學(xué)表現(xiàn)判定H.pylori感染及炎癥分級。人類胃癌細(xì)胞株AGS、MKN45、MKN28、SGC7901及非胃癌細(xì)胞株GES-1作為細(xì)胞株標(biāo)本用于本研究。應(yīng)用特異性stem-loop引物完成逆轉(zhuǎn)錄，并同時(shí)采用靈敏的TaqmanrealtimePCR技術(shù)檢測以上標(biāo)本的miR-21表達(dá)水平。結(jié)果采用2-△ΔCt方法計(jì)算不同組織及細(xì)胞間表達(dá)水平差異。應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，統(tǒng)計(jì)方法采用非配對

3、2組資料間t檢驗(yàn)來判定顯著性差異，以p＜0.05作為判定標(biāo)準(zhǔn)。 結(jié)果：胃癌組織miR-21表達(dá)水平明顯高于正常胃粘膜組織(p＜0.01;平均18.25倍)；胃癌細(xì)胞株AGS、MKN45、MKN28、SGC7901的miR-21表達(dá)水平也明顯高于非胃癌細(xì)胞株GES-1及正常胃粘膜組織(p＜0.01;平均9.2倍)；H.pylori感染胃粘膜組織中miR-21表達(dá)水平較正常胃粘膜組織明顯升高(p＜0.05，平均2倍)。 結(jié)論

4、:miR-21在胃癌組織、胃癌細(xì)胞株及H.pylori感染者胃粘膜組織中的表達(dá)水平較正常胃粘膜組織明顯升高，提示miR-21的異常表達(dá)水平與胃癌發(fā)生存在緊密聯(lián)系；同時(shí)，從H。pylori感染到胃癌組織間miR-21表達(dá)水平呈梯度升高趨勢，說明H.pylori感染可能是引起miR-21表達(dá)紊亂的始動(dòng)因素，后者可能是引起胃癌發(fā)生的重要分子機(jī)制。 第二部分：miR-21對AGS細(xì)胞功能的影響 目的：評價(jià)miR-21的異常表達(dá)對

5、AGS細(xì)胞功能的影響，包括凋亡、增殖及細(xì)胞侵襲，闡明miR-21在腫瘤發(fā)生全過程中的可能作用。 方法：應(yīng)用gain-andloss-offunction實(shí)驗(yàn)方法來驗(yàn)證miR-21表達(dá)水平變化對AGS細(xì)胞功能的影響。首先將miR-21前體(pre-miR-21)序列克隆至mscv-puro工具載體上，并轉(zhuǎn)染至AGS細(xì)胞內(nèi)，使miR-21表達(dá)水平升高；相反，通過轉(zhuǎn)染人工合成的特異性miR-21抑制劑(inhibitor)來降低AGS

6、細(xì)胞內(nèi)miR-21表達(dá)水平。應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)及細(xì)胞活力計(jì)數(shù)方法來檢測AGS細(xì)胞的凋亡及增殖功能變化，并通過transwellassay及細(xì)胞劃痕試驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力改變。數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用二樣本t檢驗(yàn)判定2組間的顯著性差異，以p＜0.05作為顯著性判定標(biāo)準(zhǔn)。 結(jié)果：轉(zhuǎn)染pre-miR-21質(zhì)粒及特異性miR-21inhibitor可以有效地升高或降低AGS細(xì)胞內(nèi)miR-21表達(dá)水平(p＜0.01，

7、升高或降低＞4倍);miR-21表達(dá)水平降低可誘發(fā)AGS細(xì)胞凋亡率明顯增加(p＜0.05，凋亡增加13.6倍)，提示miR-21在胃癌中可作為一種抗凋亡分子發(fā)揮作用；miR-21過表達(dá)可促進(jìn)AGS細(xì)胞增殖，較對照組明顯加快(p＜0.05，增加24.7％)，同時(shí)，miR-21表達(dá)水平降低可減慢AGS細(xì)胞增殖(p＜0.05，降低21.8％)；此外，AGS細(xì)胞在轉(zhuǎn)染miR-21inhibitor后，細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力均出現(xiàn)明顯的下降，較對照組

8、有明顯的差異(p＜0.05)； 結(jié)論：miR-21表達(dá)紊亂可以誘發(fā)胃癌細(xì)胞發(fā)生多種生物學(xué)功能改變，包括可以抑制細(xì)胞凋亡并促進(jìn)細(xì)胞增殖，同時(shí)可以影響細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。說明miR-21在胃癌的發(fā)生和發(fā)展全過程中都發(fā)揮作用。另一方面，我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)miR-21表達(dá)水平可通過外源性手段有效調(diào)控，提示針對miRNA表達(dá)水平的有效干預(yù)可以調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能，有望成為腫瘤治療一個(gè)新的方向。 第三部分：miR-21調(diào)控靶基因RECK表

9、達(dá)以及與細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的相互作用 目的：驗(yàn)證RECK是miR-21重要的靶基因，闡述miR-21可能通過對RECK的調(diào)控來影響AGS細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移功能。 方法：借助目前常用的miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫對miR-21的靶基因進(jìn)行預(yù)測和篩選，通過TaqmanrealtimePCR、westernblot及Luciferasereporterassay方法進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果：通過應(yīng)用miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行預(yù)測，RECK可能

10、是miR-21的一個(gè)靶基因。并且利用RT-PCR或westernblot檢測手段，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均RECK與miR-21表達(dá)在胃癌組織與正常組織間均呈負(fù)性相關(guān)；同時(shí)，轉(zhuǎn)染miR-21inhibitor的AGS細(xì)胞RECK蛋白表達(dá)水平升高，較轉(zhuǎn)染pre-miR-21質(zhì)粒AGS細(xì)胞及陰性參照間有明顯差異(p＜0.05)；Luciferasereporterassay結(jié)果進(jìn)一步證明RECK是miR-21重要的靶基因。 結(jié)論：RECK是miR