miR-21在糖尿病腎病發(fā)病過程中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）發(fā)生發(fā)展過程中，轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）可通過激活Smads信號通路誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的發(fā)生及腎間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrixc，ECM）的過度沉積，進(jìn)而造成腎組織廣泛的纖維化[

2、1]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)[2-3]，隨DN病程的進(jìn)展，可導(dǎo)致TGF-β1/Smads信號通路持續(xù)激活和微小核糖核酸-21（miR-21）表達(dá)逐漸增加，兩者均參與了EMT的發(fā)生以及ECM的沉積，從而促進(jìn)纖維化的發(fā)生發(fā)展。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)核轉(zhuǎn)錄共抑制因子SnoN（Ski-related novel protein N）作為TGF-β1/Smads信號通路的重要負(fù)調(diào)控因子，在DN發(fā)生發(fā)展過程中其蛋白水平的減少，可導(dǎo)致TGF-β1的致纖維化

3、效應(yīng)增強(qiáng)[4]。而Ski與SnoN為同一家族的成員，其啟動(dòng)子的3’UTR存在miR-21的靶位點(diǎn)，miR-21可通過結(jié)合到SKI基因3’UTR抑制該基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。但在DN發(fā)病機(jī)制中miR-21的效應(yīng)是否與SnoN有關(guān)，兩者有何關(guān)聯(lián)，目前未見報(bào)道。因此，本研究擬觀察糖尿?。―M）大鼠腎組織及高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞中miR-21和SnoN蛋白及mRNA水平的表達(dá)變化及相互影響，探討在 DN發(fā)病過程中 miR-21的作用，以及與 Sno

4、N之間的關(guān)系和可能機(jī)制，從而進(jìn)一步闡明DN腎纖維化的發(fā)病機(jī)制。
　　目的：
　　觀察糖尿?。―M）大鼠腎組織及高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞中miR-21和SnoN蛋白及mRNA的表達(dá)變化及相互影響，探討miR-21在DN發(fā)病過程中作用，以及與SnoN之間的關(guān)系和可能機(jī)制。
　　方法：
　　1.清潔級Sprague-Dawley（SD）大鼠尾靜脈注射鏈脲佐菌素（STZ）復(fù)制DM大鼠模型，并設(shè)正常對照組（NC），每組n=

5、10，于8周（w）、16w和24w分別處死各組大鼠。生化方法檢測血糖和24小時(shí)（h）尿蛋白；HE染色（hematoxylin-eosin staining）及Masson染色觀察腎組織形態(tài)變化及病理變化；免疫組織化學(xué)染色和Western blot法檢測各組大鼠腎組織SnoN、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、Smad3、p-Smad3（Ser423/425）、E鈣黏蛋白（E-cadherin）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、纖維連

6、接蛋白（FN）和膠原蛋白Ⅲ（CollagenⅢ，ColⅢ）的表達(dá)；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real time fluorescent quantitative-PCR，qRT- PCR)檢測miR-21和SnoN mRNA的表達(dá)。2.NRK-52E細(xì)胞株（大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞），采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測上皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白E-cadherin和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白α-SMA在NRK-52E中的表達(dá)和分布，觀察細(xì)胞形態(tài)以及生長狀態(tài)；分為以

7、下兩個(gè)組：予正常糖[DMEM(含糖5.5 mmol/L)+2%FBS]和高糖[19.5mmol/L D-glucose+ DMEM+2% FBS]環(huán)境分別培養(yǎng)NRK-52E細(xì)胞，每組細(xì)胞分別培養(yǎng)2 h、12h、24h和48h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)；Western blot檢測各組細(xì)胞中SnoN、TGF-β1、Smad3、p-Smad3（Ser423/425）、E-cadherin、α-SMA的表達(dá)情況；qRT-PCR技術(shù)檢測miR-21及SnoN

8、mRNA的表達(dá)情況。3.采用免疫熒光染色或免疫熒光雙染檢測E-cadherin、α-SMA在不同糖環(huán)境NRK-52E細(xì)胞的表達(dá)和分布；通過對NRK-52E細(xì)胞進(jìn)行不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，分別過表達(dá)miR-21或抑制miR-21作用后予正常糖或高糖培養(yǎng)48h；Western blot方法檢測高糖環(huán)境下，增加miR-21表達(dá)或抑制miR-21作用后對NRK-52E細(xì)胞SnoN、E-cadherin和Col-Ⅲ蛋白表達(dá)的影響；qRT-PCR技術(shù)檢測Sn

9、oN mRNA和Smad7 mRNA的表達(dá)。4.通過轉(zhuǎn)染敲低NRK-52E細(xì)胞SnoN表達(dá)后予正常糖或高糖培養(yǎng)48h，Western blot和qRT-PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率；予人重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7（bone morphogenetic protein7，BMP-7）200ng/ml加入高糖同時(shí)培養(yǎng)NRK-52E細(xì)胞48h；Western blot方法檢測SnoN、E-cadherin、Col-Ⅲ蛋白的表達(dá)；qRT-PCR技術(shù)檢測m

10、iR-21的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.生化指標(biāo)及腎組織形態(tài)學(xué)變化顯示 DM大鼠模型復(fù)制成功且并發(fā)DN；與NC組相比，DM組大鼠腎組織TGF-β1、p-Smad3（Ser423/425）、α-SMA蛋白表達(dá)增加而E-cadherin蛋白表達(dá)減少（p<0.05），miR-21和SnoNmRNA表達(dá)隨疾病進(jìn)程呈時(shí)間依賴性增加，但SnoN蛋白表達(dá)隨疾病進(jìn)展呈時(shí)間依賴性減少（p<0.05），相關(guān)性分析結(jié)果提示大鼠腎組織中 miR-2

11、1和 SnoN蛋白的表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.797，p<0.01）；2.與NG組相比，HG組腎小管上皮細(xì)胞TGF-β1、p-Smad3（Ser423/425）、α-SMA蛋白表達(dá)增加而E-cadherin蛋白表達(dá)的減少（p<0.05），miR-21表達(dá)和SnoN mRNA隨高糖刺激時(shí)間延長呈時(shí)間依賴性增加，而SnoN蛋白表達(dá)則呈時(shí)間依賴性減少（p<0.05），相關(guān)性分析結(jié)果提示 NRK-52E細(xì)胞中 miR-21和 SnoN蛋白的

12、表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.899，p<0.01）；3.NRK-52E細(xì)胞轉(zhuǎn)染pHAGE-miR-21（過表達(dá)miR-21）后高糖培養(yǎng)，高糖進(jìn)一步減少 E-cadherin的表達(dá)而增加 CollagenⅢ的表達(dá)（p<0.05），且NRK-52E細(xì)胞過表達(dá)miR-21后高糖培養(yǎng)，可顯著減少SnoN、Smad7 mRNA及蛋白的表達(dá)（p<0.05）；相反，NRK-52E細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-21-sponge（抑制miR-21作用）后高糖培養(yǎng)，

13、可見 E-cadherin的表達(dá)增加而 CollagenⅢ的表達(dá)減少（p<0.05）；4. NRK-52E細(xì)胞轉(zhuǎn)染 SnoN shRNA后高糖培養(yǎng)，進(jìn)一步減少了E-cadherin表達(dá)而增加了CollagenⅢ的表達(dá)（p<0.05），并且miR-21的表達(dá)上調(diào)；相反，若高糖培養(yǎng) NRK-52E細(xì)胞的同時(shí)加入外源性細(xì)胞因子 BMP-7，BMP-7可上調(diào)SnoN的表達(dá)，從而恢復(fù)E-cadherin的表達(dá)并下調(diào)CollagenⅢ的表達(dá)，同時(shí)可

14、減少miR-21的表達(dá)；但NRK-52E細(xì)胞轉(zhuǎn)染SnoN shRNA后予高糖和BMP-7同時(shí)培養(yǎng)，可見BMP-7上調(diào)SnoN表達(dá)、抗纖維化和抑制miR-21的效應(yīng)均被削弱。
　　結(jié)論：
　　1.DM及高糖環(huán)境下，TGF-β1通過激活腎小管上皮細(xì)胞下游的Smad3信號通路，上調(diào)miR-21的表達(dá)；增多的miR-21可能通過抑制SnoN mRNA的翻譯，導(dǎo)致SnoN蛋白水平降低，使得TGF-β1/Smad3信號通路失去控制而過度