MiR-134在癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)生中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、癲癇持續(xù)狀態(tài)(Status epilepticus，SE)的年發(fā)病率為10-40/10萬，為神經(jīng)內(nèi)科中僅次于急性腦血管病的急危重癥。約三分之一的病人經(jīng)過現(xiàn)有兩種或三種抗驚厥藥物治療后，癲癇發(fā)作仍然難以控制，進(jìn)展為難治性癲癇持續(xù)狀態(tài)(Refractory status epilepticus，RSE)，導(dǎo)致極高的死亡率和致殘率，因此，探索新的起效快、作用強(qiáng)的治療方法，成為神經(jīng)科臨床工作中亟待解決的難點(diǎn)問題。
　　近年來研究發(fā)現(xiàn)mic

2、roRNAs(miRNAs)在癲癇病的發(fā)生機(jī)制中扮演了重要角色。miRNAs作為一種高度保守的內(nèi)源性的非編碼小分子RNA，長約19-24個(gè)核苷酸。能夠通過堿基互補(bǔ)配對原則特異性地與一個(gè)或多個(gè)靶基因的 mRNA結(jié)合，導(dǎo)致mRNA降解或者翻譯抑制，從而在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控靶基因，參與神經(jīng)系統(tǒng)的諸多病理生理過程。MiR-134作為一種特異性的表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)的miRNA，主要參與神經(jīng)元微觀結(jié)構(gòu)的調(diào)控，如樹突棘的密度與長度等，進(jìn)而調(diào)控局部神經(jīng)回路

3、的興奮性。既往研究表明，在動(dòng)物癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)生過程中，海馬 miR-134表達(dá)出現(xiàn)了明顯的上調(diào)。結(jié)合其特異性的表達(dá)與生理功能，我們假設(shè)：miR-134可能參與了癲癇持續(xù)狀態(tài)的發(fā)生，對其深入研究可能為癲癇持續(xù)狀態(tài)的治療提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。
　　目的：
　　探討miR-134在癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)生中的作用以及機(jī)制。
　　方法：
　?。?）構(gòu)建大鼠miR-134抑制慢病毒載體并驗(yàn)證；
　　（2）應(yīng)用氯化鋰-匹羅卡品腹腔

4、注射建立大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型，從在體角度觀察miR-134抑制對大鼠發(fā)作潛伏期，癲癇持續(xù)狀態(tài)時(shí)間，發(fā)作嚴(yán)重程度，腦電圖功率以及海馬神經(jīng)元凋亡的影響；
　?。?）應(yīng)用無鎂細(xì)胞外液誘導(dǎo)原代培養(yǎng)神經(jīng)元持續(xù)放電，建立離體癲癇持續(xù)狀態(tài)模型，觀察miR-134抑制對神經(jīng)元放電頻率及神經(jīng)保護(hù)作用的影響；
　?。?）從離體水平研究miR-134抑制對無鎂離體癲癇持續(xù)狀態(tài)模型中神經(jīng)元樹突棘密度的影響；
　　結(jié)果：
　?。?）將一段

5、362bp的包含2個(gè)miR-134競爭結(jié)合位點(diǎn)的DNA片段經(jīng) XhoI和EcoRI酶切后插入質(zhì)粒pCDH-CMV-MCS-EG(R)FP-MCS中EGFP序列的下游，該片段轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與miR-134互補(bǔ)形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而阻止了miR-134對靶mRNA的降解或翻譯抑制。得到大鼠miR-134抑制病毒載體，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞及神經(jīng)元72小時(shí)后經(jīng)熒光顯微鏡觀察可見80％左右的細(xì)胞有綠色熒光蛋白表達(dá)，qRT-PCR檢測可見病毒組較對照組miR

6、-134表達(dá)明顯降低，說明抑制miR-134慢病毒包裝成功；
　　（2）立體定向注射miR-134抑制慢病毒于大鼠海馬并放置海馬電極，2周后建立氯化鋰-匹羅卡品大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型，進(jìn)行急性期腦電圖監(jiān)測，結(jié)果提示miR-134抑制慢病毒組較相應(yīng)對照病毒組Ⅴ級發(fā)作潛伏期延長（P<0.01），腦電圖總功率降低（P<0.001），癲癇持續(xù)狀態(tài)時(shí)間縮短（P<0.05）。癲癇持續(xù)狀態(tài)后3天制備腦片進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果提示miR-134抑制

7、慢病毒組海馬DG、CA1及CA3區(qū)較相應(yīng)對照病毒組NeuN陽性細(xì)胞數(shù)增多，Tunel陽性細(xì)胞減少；
　?。?）無鎂離體SE樣發(fā)作模型制備后72小時(shí)，miR-134表達(dá)升高（P<0.05）。MiR-134抑制慢病毒預(yù)處理組經(jīng)無鎂細(xì)胞外液處理后SE樣放電頻率較對照病毒組明顯降低（P<0.001）；活細(xì)胞數(shù)較對照病毒組增多（P<0.001）；
　　（4）同對照病毒組相比，miR-134抑制慢病毒預(yù)處理組經(jīng)無鎂細(xì)胞外液處理后（離體癲