HMGB1在幼年大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)中的作用研究.pdf

1、癲癇（epilepsy）是常見的神經(jīng)系統(tǒng)慢性疾病之一，臨床呈長期反復(fù)癇性發(fā)作的疾病過程，在兒童中發(fā)病率高，長期、頻繁或嚴(yán)重的癇性發(fā)作會導(dǎo)致進(jìn)一步的腦損傷甚至持久性神經(jīng)精神障礙，給患者本人及家庭、社會造成很大的困擾。近年來，針對癲癇的病因、發(fā)病機(jī)制及治療等的研究工作取得了很大進(jìn)展，但是癲癇發(fā)生及發(fā)展的確切機(jī)制還未完全闡明。大量研究表明癲癇持續(xù)狀態(tài)、腦外傷及缺血缺氧等腦損傷過程都伴有神經(jīng)系統(tǒng)免疫炎癥反應(yīng)，而神經(jīng)系統(tǒng)的免疫炎癥反應(yīng)可以增加神經(jīng)

2、元興奮性，促進(jìn)神經(jīng)元損傷及癲癇發(fā)生。眾多研究數(shù)據(jù)表明多種炎癥介質(zhì)參與了癲癇發(fā)生及發(fā)展過程，而抗炎治療對部分類型的癲癇發(fā)作有效，可以減輕發(fā)作程度及神經(jīng)病理學(xué)變化。
　　高遷移率族蛋白1(high-mobility group box1，HMGB1)是一種高度保守的非組DNA結(jié)合蛋白，具有穩(wěn)定核酸結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和基因表達(dá)等多種生物學(xué)功能。近年來發(fā)現(xiàn)在一定因素作用下可以釋放到細(xì)胞外發(fā)揮促炎因子作用，HMGB1可以由壞死細(xì)胞被動釋放或由活

3、化的免疫細(xì)胞主動釋放，通過與其受體如Toll樣受體4（toll-like receptor-4，TLR4），Toll樣受體2(TLR2)和晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）等結(jié)合，激活核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)及其他信號傳導(dǎo)通路，促進(jìn)炎癥因子及趨化因子的產(chǎn)生，從而發(fā)揮其促炎作用。TLR作為固有免疫受體，是近年來研

4、究較多的一類受體，主要與感染細(xì)菌及內(nèi)源性損傷相關(guān)分子結(jié)合發(fā)揮作用，其中TLR4是其中研究較熱的受體之一，廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)，包括神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，參與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病過程。
　　研究證實(shí)HMGB1參與了敗血癥、關(guān)節(jié)炎、胰腺炎、呼吸障礙、腦缺血、腦外傷、腦炎等病理過程。而HMGB1的抑制劑如中和抗體，Box A等可以減輕多種疾病中HMGB1引起的炎癥反應(yīng)，發(fā)揮一定的保護(hù)作用，相反，給予重組HMGB1可以加重炎癥反應(yīng)及

5、組織損傷。例如在敗血癥中給予HMGB1中和抗體可以減輕炎癥反應(yīng)，降低死亡率;在腦缺血和創(chuàng)傷性腦損傷中存在HMGB1的轉(zhuǎn)位活化，給予HMGB1中和抗體可以抑制HMGB1活化及炎癥反應(yīng)，減輕腦損傷，而給予重組HMGB1可增加細(xì)胞因子合成，促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞活化及加重神經(jīng)元損傷。
　　近來有研究表明在成年小鼠癲癇發(fā)生中有HMGB1/TLR4信號通路的參與，在熱性驚厥兒童中也觀察到血漿HMGB1水平升高。但是在未成年機(jī)體癲癇發(fā)作中是否有HMGB

6、1的參與以及HMGB1中和抗體在癲癇發(fā)作中是否有神經(jīng)保護(hù)作用仍不清楚，研究表明癲癇發(fā)生的易感性、神經(jīng)病理變化及預(yù)后都存在年齡依賴性，而HMGB1的表達(dá)也在一定程度上受到年齡影響，因此在本課題中，我們通過側(cè)腦室注射海人酸(kainic acid，KA)建立生后21天(postnatal day21，P21)大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus，SE)模型，研究SE后早期階段(3h-7 d)，HMGB1/TLR4通路在海馬

7、組織中的表達(dá)特點(diǎn)以及神經(jīng)元損傷特點(diǎn);并通過給予HMGB1中和抗體阻斷HMGB1活性，研究HMGB1中和抗體對癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬炎癥因子表達(dá)，膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)及神經(jīng)元損傷情況的影響，以明確HMGB1在幼鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)中的表達(dá)特點(diǎn)及作用。
　　第一部分、HMGB1/TLR4通路在幼年大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)中表達(dá)變化的研究
　　目的:
　　研究海人酸側(cè)腦室注射誘導(dǎo)P21大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬HMGB1/TLR4通路的表達(dá)變化。

8、r>　　材料與方法:
　　1.幼鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型的建立及分組選用生后21天Wistar大鼠，水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉后固定于立體定位儀。采用微量注射器緩慢將2nmol KA溶液(溶于1μl PBS）注入側(cè)腦室（坐標(biāo)為前囟后0.7mm，中線外1.3mm，深度3.0mm）。PBS對照組給予同等劑量PBS替代KA。癇性發(fā)作行為學(xué)評價(jià)根據(jù)Racine分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，持續(xù)全身發(fā)作或連續(xù)多次全身發(fā)作之間不能恢復(fù)正常狀態(tài)超過30

9、min者定義為癲癇持續(xù)狀態(tài)（Racine分級Ⅳ-V級），記錄癲癇持續(xù)狀態(tài)開始時(shí)間。在SE開始后2h給予水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射終止發(fā)作。未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)的大鼠予以剔除。
　　SE大鼠隨機(jī)分為SE后3h、6h、12h、24 h、3d和7d組，同時(shí)設(shè)立正常組和PBS對照組(根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取時(shí)間點(diǎn)為注射后24h)。
　　2.采用尼氏染色和FJB染色觀察神經(jīng)元形態(tài)及損傷情況。
　　3.采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測各組大鼠海馬

10、HMGB1和TLR4蛋白表達(dá)變化。
　　4.采用Westemblot方法檢測各組大鼠海馬HMGB1和TLR4蛋白表達(dá)變化。其中HMGB1蛋白檢測又分為總蛋白和胞漿蛋白。
　　5.采用免疫熒光雙重標(biāo)記技術(shù)檢測各組大鼠海馬HMGB1在各類細(xì)胞（神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞）中的分布變化。
　　結(jié)果:
　　1.海人酸側(cè)腦室注射誘導(dǎo)P21大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)在海人酸注射后30 min內(nèi)，所有大鼠都出現(xiàn)呼吸急促、咀嚼、動須

11、，點(diǎn)頭、濕狗樣抖動及前肢陣攣，之后逐漸出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)，站立，跌倒，強(qiáng)直陣攣發(fā)作。8％大鼠死亡，其中80％死亡出現(xiàn)于KA側(cè)腦室注射后1h以內(nèi)。觀察大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)作2h后給予水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射終止發(fā)作。而在PBS對照組無癲癇發(fā)作。
　　2.海人酸側(cè)腦室注射誘導(dǎo)P21大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬神經(jīng)元損傷尼氏染色和FJB染色顯示正常組和PBS對照組大鼠海馬無神經(jīng)元損傷。SE后6h在CA3區(qū)和Hilus區(qū)開始出現(xiàn)神經(jīng)元損傷，表現(xiàn)

12、為尼氏染色陽性細(xì)胞數(shù)減少(P＜0.01)，并出現(xiàn)FJB陽性細(xì)胞，之后神經(jīng)元損傷逐漸加重，SE后24 h可見大量神經(jīng)元損傷。而在CA1區(qū)明顯的神經(jīng)元損傷開始于SE后24h(P＜0.05)，3d明顯(P＜0.01)，并且損傷較CA3區(qū)和Hilus區(qū)輕。
　　3.海人酸側(cè)腦室注射誘導(dǎo)P21大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬HMGB1蛋白的表達(dá)變化Western blot分析顯示海馬HMGB1總蛋白無明顯變化，而胞漿HMGB1在SE后明顯增加，開始于

13、SE后3 h(P＜0.01)，24 h達(dá)高峰(P＜0.01)，之后逐漸降低，7d時(shí)仍高于正常組(P＜0.05)，PBS對照組與正常組無差異(P＞0.05)。免疫組化顯示在正常組大鼠和PBS對照組大鼠海馬中，HMGB1主要分布于細(xì)胞核內(nèi)，SE后3h開始出現(xiàn)于細(xì)胞漿中。在CA1區(qū)，SE后3h到12h，胞漿HMGB1主要出現(xiàn)于椎體細(xì)胞層中，在24 h及以后，胞漿HMGB1在膠質(zhì)形態(tài)細(xì)胞中增多。在CA3區(qū)和Hilus區(qū)，自SE后6h起可以觀察到

14、HMGB1染色缺失區(qū)域，該區(qū)域與尼氏染色和FJB染色顯示的神經(jīng)元損傷區(qū)域一致。
　　4.海人酸側(cè)腦室注射誘導(dǎo)P21大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬HMGB1的細(xì)胞定位免疫熒光雙標(biāo)顯示在正常組大鼠中，HMGB1位于神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)，無ED1陽性細(xì)胞。SE后6h，胞漿HMGB1主要出現(xiàn)于NeuN陽性的神經(jīng)元細(xì)胞。SE后24 h，HMGB1在膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)增多，并且星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)HMGB1的比例及胞漿HMGB1陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯

15、增多(P＜0.05)，另外，出現(xiàn)ED1標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞，主要表達(dá)于CA3區(qū)和Hilus區(qū)，分別有78.4±0.12％和81.2±0.08％的ED1陽性細(xì)胞與HMGB1共分布。
　　5.海人酸側(cè)腦室注射誘導(dǎo)P21大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬TLR4蛋白的表達(dá)變化Western blot分析顯示TLR4蛋白在正常組大鼠和PBS對照組大鼠海馬中的表達(dá)量很少，而在SE后明顯增加，開始于3h(P＜0.01)，24h達(dá)高峰(P＜0.01)，之后逐漸

16、降低，7d時(shí)仍高于正常(P＜0.01)。免疫組化結(jié)果顯示在正常組大鼠和PBS對照組大鼠海馬中，TLR4僅在部分大鼠有散在弱表達(dá)，SE后3h開始有表達(dá)，之后逐漸增多，在24 h之前，TLR4陽性細(xì)胞主要分布于錐體細(xì)胞層，以神經(jīng)元形態(tài)為主，在24 h之后，出現(xiàn)在膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞中。
　　結(jié)論:
　　1.在海人酸側(cè)腦室注射誘導(dǎo)P21大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后早期階段，海馬HMGB1/TLR4通路活化，并與神經(jīng)元損傷相關(guān)。
　　2.H

17、MGB1的活化即核漿轉(zhuǎn)位及胞外釋放首先發(fā)生在神經(jīng)元，隨后出現(xiàn)于膠質(zhì)細(xì)胞。
　　第二部分、HMGBl中和抗體在幼年大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)中的作用研究
　　目的：
　　研究HMGBl中和抗體對P21大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬炎癥反應(yīng)及神經(jīng)元損傷的作用。
　　方法：
　　1．幼鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型的建立
　　癲癇持續(xù)狀態(tài)模型建立方法同第一部分。
　　2．分組及藥物干預(yù)
　　SE大鼠隨機(jī)分為模型組(KA+Ig

18、Y組)和HMGBl中和抗體干預(yù)低、中、高劑量組(KA+anti-HMGBl組)。模型組通過側(cè)腦室注射給予對照IgY(4μg)，干預(yù)組分別給予HMGBl中和抗體1、2、4μg。給藥時(shí)間為SE終止即刻及SE后12h。同時(shí)設(shè)PBS對照組，在相應(yīng)時(shí)間給予對照IgY(4μg)。
　　3．實(shí)時(shí)定量RT-PCR
　　SE后6h取海馬組織提取RNA，采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢測海馬炎癥因子白介素1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子α(TNF

19、-α)mRNA的表達(dá)變化。
　　4．免疫組織化學(xué)
　　SE后3d取腦組織制作石蠟切片，通過免疫組織化學(xué)方法檢測海馬Ibal、EDl和GFAP的表達(dá)變化。
　　5．尼氏染色和FJB染色
　　SE后3d，采用尼氏染色和FJB染色方法檢測海馬神經(jīng)元形態(tài)及損傷情況。
　　結(jié)果：
　　1．HMGBl中和抗體對海馬炎癥因子的影響
　　實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果顯示SE后6h，與對照組相比，KA+IgY組大鼠海

20、馬IL-1β和TNF-αmRNA表達(dá)明顯增高(P＜0.01)。而側(cè)腦室注射中、高劑量中和抗體(2和4μg)可以明顯抑制海馬IL-1β和TNF-αmRNA表達(dá)(P＜O.05)，低劑量中和抗體(1μg)則無明顯抑制作用(P＞0.05)。
　　2．HMGBl中和抗體對海馬膠質(zhì)細(xì)胞的影響
　　免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示SE后3d，KA+IgY組大鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞(Iba1和ED1)和星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP)免疫染色較對照組明顯增強(qiáng)(P＜0

21、.01)。而側(cè)腦室注射中、高劑量中和抗體(2和4μg)可以明顯抑制海馬Iba1、ED1和GFAP免疫染色強(qiáng)度(P＜0.01)，低劑量中和抗體(1μg)則無明顯抑制作用(P＞0.05)。
　　3. HMGB1中和抗體對海馬神經(jīng)元損傷的影響
　　尼氏染色和FJB染色顯示SE后3d，對照組海馬神經(jīng)元形態(tài)正常，無損傷，KA+IgY組大鼠海馬神經(jīng)元損傷明顯，表現(xiàn)為尼氏染色陽性神經(jīng)元明顯減少，而FJB染色陽性神經(jīng)元顯著增多(P＜0.01

22、)，且CA3區(qū)、Hilus區(qū)較CA1區(qū)神經(jīng)元損傷明顯。而側(cè)腦室注射中、高劑量中和抗體(2和4μg)可以明顯減輕神經(jīng)元損傷(P＜0.05)，低劑量中和抗體(1μg)則無明顯作用(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.海人酸側(cè)腦室注射誘導(dǎo)的P21大鼠癲痛持續(xù)狀態(tài)可以促進(jìn)海馬炎癥因子合成，膠質(zhì)細(xì)胞活化及神經(jīng)元損傷。
　　2.側(cè)腦室注射HMGB1中和抗體可以劑量依賴性的抑制海馬炎癥因子合成及膠質(zhì)細(xì)胞活化，減輕神經(jīng)元損傷，發(fā)揮神