中國產(chǎn)NDM-1細菌流行現(xiàn)狀及blaNDM-1基因跨種屬轉(zhuǎn)移機制研究.pdf

1、NDM-1型碳青霉烯酶是2009年發(fā)現(xiàn)的一種新型金屬β-內(nèi)酰胺酶，具有對頭孢菌素及碳青霉烯類抗生素的高效水解活性。至今，產(chǎn)NDM-1酶菌株已經(jīng)呈全球范圍播散，成為嚴(yán)重威脅人類健康的“超級細菌”。但是目前，我國NDM-1菌株的流行病學(xué)數(shù)據(jù)缺乏，blNDM-1基因迅速播散的機制仍不明確。
　　本研究第一部分對收集于2009年1月至2010年9月間來自全國18個省市，57家醫(yī)院的非重復(fù)革蘭陰性桿菌12024株，其中大腸埃希菌3439株、

2、肺炎克雷伯菌2840株、不動桿菌屬細菌2835株以及銅綠假單胞菌2910株，運用PCR技術(shù)對blaNDM-1基因進行篩查。結(jié)果發(fā)現(xiàn)13株菌攜帶有blaNDM-1基因，均為不動桿菌屬細菌?；颊吡餍胁W(xué)資料回顧性分析結(jié)果顯示:其中8位患者年齡＞60歲、4位＜7歲，13位患者中只有2例發(fā)生死亡;所有患者半年內(nèi)均未有出國旅游史。13株菌來自于10個不同的省份及9個不同的科室，7例來源于痰標(biāo)本、3例血液、2例分泌物及1例尿液標(biāo)本。
　　篩查

3、結(jié)果提示，在我國NDM-1菌株尚未出現(xiàn)流行，不動桿菌屬細菌為blNDM-1基因的重要攜帶菌，這與國外眾多研究結(jié)果不同。由于不動桿菌屬菌種數(shù)目多、菌種間性狀相似度高，該屬細菌的菌種鑒定一直是個難點。為對13株菌進行準(zhǔn)確菌種鑒定，我們除使用生化鑒定外，依次采用了blaOXA-51-1ike基因、16S-23SrRNA ITS區(qū)序列、ARDRA酶切分析及rpoB基因序列分析等四種方法。結(jié)果顯示13株菌中，A.baumannii4株，A.pit

4、tii3株， A.lwoffii、A.johnsonii、A.genospecies10、A.haemolyticuS、A.junii及 A.genospecies15TU各1株。運用E-test藥敏條對菌株進行抗菌藥物MIC值測試，結(jié)果顯示13株不動桿菌菌株對包括碳青霉烯類在內(nèi)的所有β-內(nèi)酰胺類抗生素表現(xiàn)出一致的體外耐藥表型，對氨基糖苷類（慶大霉素和阿米卡星）、喹諾酮類（環(huán)丙沙星）及單環(huán)酰胺類（氨曲南）等抗生素的藥敏表型有差異，對多粘

5、菌素類（多粘菌素）、甘氨酰環(huán)素類（替加環(huán)素）及四環(huán)素類（米諾環(huán)素）均表現(xiàn)為敏感。
　　在此基礎(chǔ)上，本研究的第二部分內(nèi)容通過S1-酶切后脈沖場凝膠電泳(S1-PFGE)聯(lián)合Southern blot雜交技術(shù)對13株不動桿菌屬細菌的blaNDM-1基因進行定位，運用質(zhì)粒接合實驗及轉(zhuǎn)化實驗驗證質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性;通過酶切克隆研究blaNDM-1基因的周圍結(jié)構(gòu);進一步運用第二代高通量測序技術(shù)完成了ABC8415菌株blaNDM-1質(zhì)粒的測序，

6、并根據(jù)pABC8415質(zhì)粒序列設(shè)計引物進行PCR mapping研究其余12株菌的blaNDM-1質(zhì)粒序列結(jié)構(gòu)特點，對blaNDM-1質(zhì)粒結(jié)構(gòu)與耐藥基因傳遞間的關(guān)系進行了深入探討。
　　本部分實驗結(jié)果提示，所有菌株blaNDM-1基因均定位于質(zhì)粒上，質(zhì)粒大小30～55kb。除菌株ABC207外，其余12株菌的blaNDM-1質(zhì)粒均通過接合成功進入E.coli J53接合受體菌中，藥敏結(jié)果提示E.coli J53接合子對頭孢菌素類抗

7、生素耐藥，但對碳青霉烯類仍表現(xiàn)為敏感，推測可能是由于供、受體菌間種屬的差異導(dǎo)致NDM-1酶不能在受體菌E.coli J53中充分表達所致。9株非鮑曼不動桿菌blaNDM-1質(zhì)粒均能通過轉(zhuǎn)化的方式進入電轉(zhuǎn)感受態(tài)細菌A.baylyi ADP1，轉(zhuǎn)化子成功獲得NDM-1酶介導(dǎo)對頭孢菌素類及碳青霉烯類抗生素的耐藥性。
　　blaNDM-1基因周圍結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示該基因位于具有轉(zhuǎn)移功能的大片段轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)Tn125上，該完整的Tn125轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)

8、為9個基因的串聯(lián)排列，順序為:ISAba125-blNDM-1-bleo-trpF-dsbc-cutA(1)-groES-groEL-ISAba125。在13株菌中發(fā)現(xiàn)了5種不同大小的轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)（命名為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ型轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)）。此5種轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)的主要區(qū)別是blaNDM-1基因下游序列發(fā)生了不同長度的截短，推測下游拷貝的ISAba125轉(zhuǎn)座酶是參與轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的主要原因;而上游拷貝的ISAba125與blaNDM-1基因關(guān)系密切，構(gòu)成穩(wěn)

9、定的ISAba125-blaNDM-1基因簇，是介導(dǎo)blaNDM-1基因在不同菌種間傳遞的主要轉(zhuǎn)移酶。為明確ISAba125對blaNDM-1基因轉(zhuǎn)移的作用以及blaNDM-1基因在不同種屬細菌（包括腸桿菌科細菌及非發(fā)酵菌）中的進化關(guān)系，我們從NCBI上公布的、來源于不同菌屬菌種的、帶有IS Aba125-blaNDM-1基因簇的參考序列中挑選出了9條序列，與本研究中13條序列進行基因相似性聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，分析親緣關(guān)系。納入的

10、參考序列來源菌種分別為大腸埃希菌2株、弗氏枸櫞酸桿菌1株、普羅威登菌屬2株、鮑曼不動桿菌2株以及銅綠假單胞菌2株。結(jié)果發(fā)現(xiàn)22條序列分為兩簇ClusterⅠ及Ⅱ，9條參考序列與8條本實驗序列均歸入ClusterⅠ簇，另外5條歸入ClusterⅡ簇，兩簇間親緣關(guān)系非常近，序列相差最多6bp。也就是說ISAba125-blaNDM-1基因簇在不同種屬細菌中具有穩(wěn)定性，不同種屬細菌間ISAba125-blaNDM-1的進化關(guān)系是平行的。

11、>　　pABC8415質(zhì)粒全長39365bp，具有31個CDS，其中已知蛋白20個，未知蛋白11個，未找到質(zhì)粒復(fù)制相關(guān)蛋白。質(zhì)粒結(jié)構(gòu)包括了兩個部分:骨架區(qū)及可變區(qū)。骨架區(qū)編碼與質(zhì)粒復(fù)制、轉(zhuǎn)移及毒力等功能相關(guān)的基本蛋白，GC含量為37.26％;可變區(qū)則即blaDM-1基因所在Tn125轉(zhuǎn)座區(qū)，GC含量高達61.42％。PCR mapping結(jié)果揭示其余12株細菌blaNDM-1質(zhì)粒與pABC8415質(zhì)粒結(jié)構(gòu)非常相似，該類未知型別質(zhì)粒僅在N

12、DM-1不動桿菌屬細菌中特異性存在。根據(jù)Tn125轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)區(qū)的GC含量變化推測該區(qū)域外源性的可能性大，攜帶有blaNDM-1基因的Tn125轉(zhuǎn)座子以大片段水平轉(zhuǎn)移的方式進入質(zhì)粒。通過比對Tn125轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)序列在不動桿菌屬與腸桿菌科細菌間的差異,我們推測blaNDM-1基因是從其他未知高GC物種經(jīng)由不動桿菌屬細菌進入腸桿菌科細菌中的進化順序。
　　本部分研究可以得出以下幾個結(jié)論:blaNDM-1質(zhì)粒及ISAba125轉(zhuǎn)座酶是介導(dǎo)bl

13、aNDM-1基因在不動桿菌屬不同菌種間水平轉(zhuǎn)移的重要轉(zhuǎn)座元件;而不動桿菌屬細菌是blaNDM-1基因進入腸桿菌科細菌的關(guān)鍵中間環(huán)節(jié)。
　　鑒于國外有關(guān)blaNDM-1基因廣泛存在于腸桿菌科細菌質(zhì)粒上的報道，為了解blaNDM-1質(zhì)粒在腸桿菌科細菌與不動桿菌屬細菌之間序列特征上的差異，探索blaNDM-1基因的跨種屬水平轉(zhuǎn)移機制，我們對一株來源于弗氏枸櫞酸桿菌的blaNDM-1質(zhì)粒進行了研究。
　　通過基因定位實驗發(fā)現(xiàn)blaN

14、DM-1基因定位于50～78.2kb大小的可轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒上，質(zhì)粒型別IncX3型，金質(zhì)粒GC含量49.03％。該blaNDM-1質(zhì)粒結(jié)構(gòu)也由骨架區(qū)(40kb)及可變區(qū)(14kb)兩部分組成。質(zhì)粒的骨架區(qū)包括了諸如復(fù)制蛋白基因（repB gene）及鞭毛基因(pilX genes)等編碼質(zhì)粒功能蛋白的基因。blNDM-1基因定位于可變區(qū)，該區(qū)同時含有另一個β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因blSHV-12，位于blaNDM-1基因下游;可變區(qū)有許多與基因

15、轉(zhuǎn)移相關(guān)的IS元件或轉(zhuǎn)座子，如IS26，ISAba125、 IS26、IS5、tnpA和tnpF; blaNDM-1基因上游的ISAba125轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)被IS5轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)插入打斷。通過比對該質(zhì)粒序列與不動桿菌屬Ⅰ型Tn125轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)，我們發(fā)現(xiàn)兩者均攜帶有與blaNDM-1基因親緣關(guān)系密切的一簇基因blaNDM-1-bleo-trpF-dsbC-cutA1-groEL-insE-tppA，片段大小8321bp，該區(qū)域的GC含量為58％，命名為

16、NCT（NDM-1 composite transposon，NDM-1復(fù)合轉(zhuǎn)座子）區(qū);而pCFNDM-CN除NCT區(qū)以外的區(qū)域與肺炎克雷伯菌pIncX-SHV質(zhì)粒（序列號JN247852）很相似（覆蓋度96％，相似度99％）。因此，我們推測NCT區(qū)是外源性的，是由ISAba125轉(zhuǎn)座酶攜帶從不動桿菌屬細菌跨種屬水平轉(zhuǎn)移到肺炎克雷伯菌pIncX-SHV質(zhì)粒中。
　　綜上所述，通過本研究發(fā)現(xiàn)我國尚未出現(xiàn)產(chǎn)NDM-1酶菌株流行的情況;