中國產(chǎn)NDM細菌流行現(xiàn)狀及我院產(chǎn)KPC-2細菌的分離與耐藥性研究.pdf

1、目的:
　　細菌耐β-內(nèi)酰胺類抗生素的主要機制是其產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶，導(dǎo)致β-內(nèi)酰胺環(huán)抗生素（如青霉素、頭孢菌素類抗生素）水解或活性減少。β-內(nèi)酰胺酶主要包括超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（Extended-spectrumβ-lactamases，ESBLs）及碳青霉烯酶，產(chǎn)上述酶的細菌廣泛播散與流行，使得β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥問題日益嚴重，已成為全球的公共衛(wèi)生問題。尤其是碳青霉烯酶的出現(xiàn)及迅速傳播，導(dǎo)致細菌對碳青霉烯類抗生素耐藥，幾乎突破了

2、臨床抗感染治療的最后一道防線。
　　目前三種主流的碳青霉烯酶:Ambler分類中的A類(KPC)、B類（金屬酶）以及D類（OXA-48型）。KPC型碳青霉烯酶于2001年在美國北卡羅來納首次被發(fā)現(xiàn)，到目前已發(fā)展了KPC-1～KPC-17共17種亞型，它們之間只有個別氨基酸發(fā)生突變，其中KPC-2為存在的主要亞型。KPC型的編碼基因blaKPC主要存在于細菌質(zhì)粒上，可在不同菌種間傳播，攜有blaKPC質(zhì)粒的腸道細菌可定植于患者體內(nèi)并

3、通過交通運輸迅速播散，質(zhì)粒編碼的blaKPC現(xiàn)幾乎已在全球各地廣泛流行。在我國，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院分別于2007年與2011年報道了國內(nèi)第一例產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌和第一例產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶的銅綠假單胞菌，而我院尚無該型碳青霉烯酶的報道及研究;D類酶中的OXA-48型碳青霉烯酶主要在地中海及歐洲南部國家快速蔓延;而B類碳青霉烯酶，又稱金屬酶，其中NDM型金屬酶可高效水解除替加環(huán)素和多粘菌素外的所有抗生素，目

4、前有NDM-1～NDM-10共10個亞型，最常見的是NDM-1型，NDM-1現(xiàn)已波及多個菌種:肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、沙雷氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、假單胞菌屬、不動桿菌屬等，這些攜帶有耐藥基因blaNDM-1的臨床的主要致病菌是嚴重創(chuàng)傷、敗血癥、手術(shù)后相關(guān)感染的巨大潛在威脅，尤其是人們生活中普遍存在的大腸桿菌（社區(qū)獲得性感染、泌尿系統(tǒng)感染及細菌性腹瀉的主要致病菌）被發(fā)現(xiàn)可攜帶耐藥基因blaNDM-1。相關(guān)報道還指出blaNDM-1基因常與其

5、他β-內(nèi)酰胺酶基因共存于細菌可轉(zhuǎn)移的基因元件上，使多重耐藥性廣泛傳播，導(dǎo)致攜帶該類基因的細菌成為全球公共衛(wèi)生威脅。
　　本研究的目的是:第一，初步了解近年我國產(chǎn)NDM型的細菌的檢出率、具體NDM碳青霉烯酶分型、陽性菌種分布及相關(guān)陽性細菌的常見β-內(nèi)酰胺酶基因的攜帶情況;第二，對我院未檢出blaNDM基因的耐藥細菌，進行blaKPC篩查，了解我院blaKPC基因的檢出情況、碳青霉烯酶KPC的具體分型及相關(guān)陽性細菌的常見β-內(nèi)酰胺酶基

6、因的攜帶情況，并進一步研究耐藥基因的傳播性與耐藥性。
　　方法:
　　第一部分研究內(nèi)容:
　　1.菌株收集收集全國38個城市61家醫(yī)院2009年1月-2014年3月臨床分離的1150株耐碳青霉烯類抗生素的無重復(fù)的革蘭氏陰性菌，包括不動桿菌541株、肺炎克雷伯菌178株、假單胞菌屬241株及其他腸桿科細菌190株。菌株來源為便、痰、尿、血、分泌物、導(dǎo)管、引流液等臨床標本。送檢標本經(jīng)VITEK2 Compact全自動微生物

7、分析系統(tǒng)進行菌株鑒定和抗生素的最低抑菌濃度(MIC)測定，參照CLSI-2013的判斷折點。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922、陰溝腸桿菌ATCC700323、銅綠假單胞菌ATCC27853。
　　2.耐藥基因篩查 PCR初篩blaNDM基因，陽性菌株進行常見的其他β-內(nèi)酰胺酶基因篩查，包括碳青霉烯酶基因:blaGES、blaKPC、blaIMI blaBIC、blaIMP、blaVIM、blaTMB、blaFM、blaSPM

8、、blaDIM、blaGIM、blaSIM、blaAIM、blaSMB、blaOXA-23-like、blaOXA-24-like、blaOXA-48-like、blaOXA-58-like、blaOXA-143-like、blaOXA-235-like,ESBLs基因:blaCTX-M-1group、blaCTX-M-2group、 blaCTX-M-8group、blaCTX-M-9group、blaCTX-M-25group、bl

9、aTEM、blaSHV、blaGES、blaPER、blaVEB、blaOXA-1-like。
　　3.菌種鑒定聯(lián)合應(yīng)用特異基因擴增、16SrDNA擴增測序比對、rpoB擴增測序比對及MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)對blaNDM基因陽性細菌進行菌種鑒定，以確保鑒定到種水平。
　　第二部分研究內(nèi)容:
　　1.菌株選取我院分離自2013年6月-9月的155株耐碳青霉烯類抗生素的無重復(fù)革蘭陰性菌，菌株分離自便、痰、尿、血、分泌物

10、、導(dǎo)管、引流液等臨床標本，包括不動桿菌、肺炎克雷伯菌、假單胞菌屬及其他菌株。以上菌株于第一部分研究中未篩出blaNDM基因。
　　2.耐藥基因篩查及傳播機制研究 PCR初篩blaKPC基因，陽性菌株進行常見的其他β-內(nèi)酰胺酶基因篩查，包括碳青霉烯酶基因:blaGES、blaIMI、blaBIC、blaIMP、blaVIM、blaTMB、blaFIM、blaSPM、blaDIM、blaGIM、blaSIM、blaAIM、blaSMB

11、、blaOXA-23-like、blaOXA-24-like、 blaOXA-48-like、blaOXA-58-like、blaOXA-143-like、blaOXA-235-like,ESBLs基因: blaCTX-M-1group、blaCTX-M-2group、blaCTX-M-8group、blaCTX-M-9group、blaCTX-M-25group、blaTEM、blaSHV、blaGES、 blaPER、blaVEB、

12、blaOXA-1-like;相關(guān)陽性基因的測序比對以確定亞型，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化實驗、Carba NP實驗和藥敏試驗驗證陽性耐藥基因的傳播性。
　　3.菌種鑒定應(yīng)用特異基因擴增、16SrDNA擴增測序比對及MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)對blaKPC基因陽性的菌株進行菌種鑒定，以保證鑒定準確性。
　　結(jié)果:
　　第一部分研究結(jié)果:
　　1.blaNDM基因檢出情況共檢出46株blaNDM基因陽性的細菌，總檢出率為4％。陽性菌株

13、分離標本包括糞便16株、痰標本16株、尿標本6株、血培養(yǎng)4株、分泌物2株、導(dǎo)管培養(yǎng)1株、引流液1株，來自14個不同城市及15個不同的科室。所有基因均為blaNDM-1型。陽性菌株包括11株湯氏不動桿菌、2株魯菲不動桿菌、2株鮑曼不動桿菌、3株皮特不動桿菌、1株約翰遜不動桿菌、肺炎克雷伯菌11株，弗氏枸櫞酸桿菌6株，大腸埃希菌4株，陰溝腸桿菌、非脫羧勒克菌各2株，解鳥氨酸拉烏爾菌、產(chǎn)氣腸桿菌各1株。
　　2.其他β-內(nèi)酰胺酶基因檢出

14、情況 blaNDM-1基因陽性菌株其他β-內(nèi)酰胺酶基因檢出結(jié)果:2株弗氏枸櫞酸桿菌blaKPC-2基因陽性;6株湯氏不動桿菌和2株皮特不動桿菌blaOXA-58基因陽性;1株弗氏枸櫞酸桿菌blaIMP-4基因陽性;1株肺炎克雷伯菌和1株弗氏枸櫞酸桿菌blaCTX-M-1group中的blaCTX-M-15基因陽性，6株肺炎克雷伯菌、2株弗氏枸櫞酸桿菌、1株大腸桿菌、1株非脫羧勒克菌、1株陰溝腸桿菌blaCTX-M-1 group中的bl

15、aCTX-M-3基因陽性;16株blaTEM基因陽性，包括7株肺炎克雷伯菌、4株弗氏枸櫞酸桿菌、2株大腸桿菌、2株陰溝腸桿菌及1株非脫羧勒克菌;4株肺炎克雷伯菌、1株陰溝腸桿菌blaSHV-12基因陽性，1株肺炎克雷伯菌blaSHV-5基因陽性;13株細菌blaOXA-1基因陽性，包含4株肺炎克雷伯菌、4株弗氏枸櫞酸桿菌、2株湯氏不動桿菌、1株大腸桿菌、1株陰溝腸桿菌及1株非脫羧勒克菌。
　　第二部分研究結(jié)果:研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)1株分離

16、自患者痰標本的攜帶有blaKPC和blaSHV基因的肺炎克雷伯菌和1株分離自患者尿標本的攜帶blaKPC基因的銅綠假單胞菌。對陽性基因擴增測序比對后發(fā)現(xiàn)blaKPC均為blaKPC-2型，blaSHV為blaSHV-11型。通過電轉(zhuǎn)化實驗證實了blaKPC-2基因的可轉(zhuǎn)移性，同時應(yīng)用CarbaNP實驗、藥敏試驗發(fā)現(xiàn)該基因可于轉(zhuǎn)化子中成功表達A型β-內(nèi)酰胺酶，導(dǎo)致細菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥。
　　結(jié)論:
　　我國近年產(chǎn)NDM

17、-1菌株的檢出率高達4％，遠遠大于2009-2010年的0.1％，同時攜帶blaNDM-1的細菌不再局限于不動桿菌屬，而是廣泛涉及腸桿科細菌，包括肺炎克雷菌、大腸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌等。對blaNDM-1基因的全序擴增及對應(yīng)氨基酸序列的發(fā)育樹構(gòu)建發(fā)現(xiàn)，檢出的blaNDM-1基因序列表達的氨基酸序列完全一致，同源性一致。我國攜帶blaNDM-1的細菌所含的耐藥基因復(fù)雜，可同時攜帶多種其他β-內(nèi)酰胺酶基因:blaCTX-M-1 group、

18、blaTEM、blaOXA-1-like、blaSHV、blaIMP、blaKPC及blaOXA-58-like的一個或多個。
　　我院檢測的155株耐藥菌株未檢出blaNDM基因，但發(fā)現(xiàn)可隨質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的碳青霉烯酶基因blaKPC-2，該基因能夠使轉(zhuǎn)化子成功表達A型β-內(nèi)酰胺酶，導(dǎo)致細菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，同時發(fā)現(xiàn)我院blaKPC-2基因可與blaSHV-11基因共同存在于細菌中，只是blaSHV-11并未在轉(zhuǎn)化子中表達，考慮