豬源產(chǎn)NDM-1大腸埃希菌的傳播特性研究.pdf

1、產(chǎn)NDM-1細(xì)菌是一類新型細(xì)菌，幾乎對所有抗生素都有耐藥性，給人類健康帶來極大威脅。自2008年首次被發(fā)現(xiàn)以來，從人類病原菌群、正常菌群甚至環(huán)境微生物中均發(fā)現(xiàn)了該類細(xì)菌。但是，目前在動物體內(nèi)檢出產(chǎn) NDM-1細(xì)菌的報道很少。本研究從豬的病例中成功分離到2株產(chǎn) NDM-1大腸埃希氏菌并對其仔豬感染特性、跨種感染特性、耐藥質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移特性等進行了系統(tǒng)研究，為評估豬源產(chǎn) NDM-1大腸埃希氏菌在豬群內(nèi)部的擴散能力及發(fā)生跨種傳播的潛在風(fēng)險提供了參

2、考依據(jù)。同時，對于豬源產(chǎn) NDM-1細(xì)菌的防制、公共衛(wèi)生和保障動物源性食品安全具有重要意義。
　　1.豬源產(chǎn)NDM-1大腸埃希菌的分離鑒定。通過細(xì)菌的培養(yǎng)特性、形態(tài)學(xué)觀察、生化鑒定、耐藥表型和分子生物學(xué)鑒定，從2個不同豬群的感染病例中分離出2株產(chǎn)NDM-1大腸埃希菌。革蘭氏染色鏡檢結(jié)果表明2個分離菌株均為能運動、無芽孢的革蘭氏陰性短桿菌。藥敏試驗結(jié)果顯示，2個分離株均對鏈霉素、氯霉素和多粘菌素高度敏感，對大觀霉素、四環(huán)素和呋喃唑酮

3、中度敏感，對阿莫西林等其他15種抗生素均耐藥。最小抑菌濃度試驗表明，2株菌對厄他培南、美羅培南等碳青霉烯類抗生素具有很強的耐藥特性。同時，2個分離株均能在含有1 mg/mL厄他培南的TSA平板上生長。生化鑒定結(jié)果表明該2個分離株均符合大腸埃希菌的生化特征。全自動微生物鑒定儀的鑒定結(jié)果表明2個分離株均為大腸埃希菌，可信度均在99.9％以上?；趗id基因的PCR鑒定結(jié)果也表明均為大腸埃希菌。16S rRNA基因的序列分析結(jié)果表明2個分離菌

4、株與 NCBI中已發(fā)布的大腸埃希菌16S rRNA基因的同源性均在99%以上，在系統(tǒng)發(fā)育進化樹中與韓國光州雞源大腸埃希菌 Chicken11株（GenBank登錄號：JX041515.1）親緣關(guān)系最近。2株細(xì)菌均能擴增到281 bp的特異性blaNDM-1基因片段，其與NCBI已公布人源大腸埃希菌 blaNDM-1基因（GenBank登錄號：KT593873.1）的同源性在99%以上。這些試驗結(jié)果表明，2個分離株均為產(chǎn) NDM-1大腸埃

5、希菌，將其分別命名為E120413株、E131225株。
　　2.產(chǎn)NDM-1大腸埃希菌的仔豬感染特性研究。通過仔豬感染試驗研究了豬源產(chǎn)NDM-1大腸埃希菌E120413株在豬群中的交互傳播、致病力和體內(nèi)分布特性。仔豬糞便樣本的細(xì)菌學(xué)檢測結(jié)果表明，E120413株細(xì)菌能從接種仔豬快速傳染給未接種的同居組仔豬；接種組仔豬糞便樣本檢測到 E120413株細(xì)菌的持續(xù)時間最短為7 w，最長超過11 w；同居組的持續(xù)時間介于7~9 w之間。

6、仔豬血液樣本的檢測結(jié)果表明，E120413株細(xì)菌能快速突破仔豬的免疫防御進入血液循環(huán)形成菌血癥；接種組和同居組仔豬菌血癥的持續(xù)時間為第2~10天和第4~10天，并在第7天達(dá)到最高活菌濃度3.7×105和4.3×105 CFU?mL-1。仔豬組織樣本的檢測結(jié)果表明，從感染仔豬的腦、心、肝等7種組織中均能分離到該菌，且能在十二指腸長期存在（≥11 w）。但仔豬的臨床癥狀與病理學(xué)檢查結(jié)果表明，該菌僅能引起感染豬的體溫升高和輕微的局部炎癥反應(yīng)，

7、并不能導(dǎo)致豬的明顯臨床癥狀和嚴(yán)重病例變化。這些試驗結(jié)果表明，產(chǎn)NDM-1大腸埃希菌E120413株對豬具有較強的傳播擴散能力和持續(xù)感染能力，但其致病力較弱。
　　3.產(chǎn)NDM-1大腸埃希菌的跨種感染特性研究。通過動物感染試驗研究了豬源產(chǎn)NDM-1大腸埃希菌E120413株對豚鼠、小鼠和雛雞的的跨種感染特性。按照1.10×109 CFU/只的劑量通過口服途徑分別接種豚鼠、小鼠和雛雞，并與未接種對照組動物混合飼養(yǎng)。試驗結(jié)果表明，接種組

8、和同居組豚鼠分別介于2~16 d和4~10 d；接種組和同居組小鼠糞便樣本中能檢測到 E120413株的時間分別介于2~26 d和4~18 d；接種組雛雞介于2~6 d，同居組雛雞只在接種4 d能檢測到。在整個試驗過程中，均未從3種動物的血液和內(nèi)臟器官中檢測到 E120413株細(xì)菌。臨床癥狀觀察結(jié)果表明，接種組和同居組實驗動物的精神狀態(tài)和食欲情況均正常，均沒有發(fā)生腹瀉、嘔吐、呼吸困難和死亡等癥狀。病理組織學(xué)結(jié)果表明，通過與空白對照組健康

9、試驗動物對比，接種組和同居組小鼠、雛雞各組織臟器結(jié)構(gòu)完整、細(xì)胞排列規(guī)則，無出血、壞死等病理變化；接種組和同居組豚鼠的肝臟、腎臟有輕微淤血，接種組豚鼠的胃粘膜有輕微出血；其余組織臟器無明顯病理變化。這些試驗結(jié)果表明，E120413株對豚鼠、小鼠和雛雞的感染能力均弱于對豬的感染能力，其持續(xù)感染能力強弱依次為：豬>小鼠>豚鼠>雞。
　　4.豬源產(chǎn) NDM-1大腸埃希菌耐藥質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移特性研究。以豬源產(chǎn) NDM-1大腸埃希菌 E120413

10、株和 E131225株為供體菌，豬源多殺性巴氏桿菌 PM-23株、鏈球菌 Z1株、馬鏈球菌獸疫亞種 M1株、馬鏈球菌獸疫亞種 M2株、棒狀桿菌 LY-1株、沙門氏菌 C78-1株、支氣管敗血波氏桿菌 HH0809株，以及大腸埃希菌J53株、人源耐苯唑西林金黃色葡萄球菌AY01株共9株細(xì)菌為受體菌進行接合轉(zhuǎn)移試驗，結(jié)果表明 E120413株和 E131225株細(xì)菌均能把自身攜帶的blaNDM-1質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移到9株受體菌中；E120413株