碳青霉烯類(lèi)耐藥菌NDM-1質(zhì)粒獲取的危險(xiǎn)因素和周?chē)颦h(huán)境研究.pdf

1、目的：
　　區(qū)域性播散是造成質(zhì)粒編碼NDM-1酶(New Delhi metallo-β-lactamase1,即新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶-1)廣泛流行的主要原因，然而其相關(guān)的危險(xiǎn)因素和基因周?chē)h(huán)境尚未見(jiàn)系統(tǒng)性報(bào)道。本研究通過(guò)收集篩選我院產(chǎn)NDM-1酶的碳青霉烯耐藥菌，在調(diào)查blaNDM-1基因的流行狀況的基礎(chǔ)上，對(duì)含NDM-1基因耐藥菌株感染的臨床危險(xiǎn)因素與預(yù)后進(jìn)行分析，提取含blaNDM-1基因的質(zhì)粒進(jìn)行全基因組測(cè)序和生物信息

2、學(xué)分析研究，系統(tǒng)探討 NDM-1基因的流行狀況，blaNDM-1基因耐藥菌株的影響因素和預(yù)后，進(jìn)一步分析質(zhì)粒中NDM-1的基因周?chē)h(huán)境，并與國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究進(jìn)行比較。對(duì)揭示 NDM-1耐藥基因的流行、易感因素和進(jìn)化趨勢(shì)具有重要意義。為制訂科學(xué)、有效的預(yù)防和控制措施提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1、收集和篩選我院臨床標(biāo)本中對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素不敏感的革蘭氏陰性桿菌（剔除同一患者同一部位的重復(fù)菌株），應(yīng)用PCR技術(shù)進(jìn)行blaNDM

3、-1基因陽(yáng)性標(biāo)本篩查，將保存的鑒定為blaNDM-1基因陽(yáng)性的混合菌液傳代培養(yǎng)，并將傳代培養(yǎng)的菌液行blaNDM-1基因篩查，由于分離的菌種數(shù)目多，菌種復(fù)雜，含有革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌，應(yīng)用 BIOLOG自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定同時(shí)擴(kuò)增細(xì)菌16srRNA進(jìn)行測(cè)序，明確含blaNDM-1基因的菌種，應(yīng)用E-test法檢測(cè)菌株抗菌藥物敏感性、MIC值及金屬酶表型篩選實(shí)驗(yàn)。通過(guò)耐藥性和金屬酶表型篩選實(shí)驗(yàn)，獲得上述含blaNDM-1基因的耐藥菌

4、株數(shù)據(jù)，結(jié)合臨床資料進(jìn)行分析。
　　2、運(yùn)用病例對(duì)照研究方法，將含NDM-1酶細(xì)菌感染的患者為A組，另按l：1：1的比例配對(duì)，分離出碳青霉素類(lèi)不敏感細(xì)菌（NDM-1基因陰性）的患者為B組和碳青霉烯類(lèi)抗生素敏感的細(xì)菌的患者為C組進(jìn)行研究，采用病歷信息收集回顧性研究的方法，制作調(diào)查表后查閱出院病歷，調(diào)查患者的住院科室、姓名、性別、年齡、住院時(shí)間、基礎(chǔ)疾病、危險(xiǎn)因素、臨床結(jié)局等資料，通過(guò)單因素和多因素Logstic回歸分析碳青霉烯類(lèi)耐藥

5、菌NDM-1質(zhì)粒獲取的危險(xiǎn)因素。
　　3、質(zhì)粒接合試驗(yàn)驗(yàn)證blaNDM-1基因遺傳穩(wěn)定性，對(duì)于分離的能夠穩(wěn)定遺傳blaNDM-1基因的菌株，Southern blot對(duì)blaNDM-1進(jìn)行基因定位。提取質(zhì)粒DNA，將滿(mǎn)足要求（含有NDM-1基因）的5個(gè)質(zhì)粒分別構(gòu)建基因組測(cè)序文庫(kù)，將blaNDM-1質(zhì)粒進(jìn)行高通量測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接及比對(duì)，進(jìn)行質(zhì)粒gap的填補(bǔ)及差異序列驗(yàn)證，并注釋質(zhì)粒系列的基因。將得到的質(zhì)粒序列輸入到NCBI在

6、線(xiàn)網(wǎng)站中進(jìn)行Blast比對(duì)，利用Mauve軟件進(jìn)行對(duì)比詳細(xì)查看不同點(diǎn)。
　　結(jié)果：
　　1、1735株碳青霉烯類(lèi)抗生素不敏感細(xì)菌中，一共篩選到含blaNDM-1基因菌株54株，其中肺炎克雷伯菌中篩到陽(yáng)性菌株44株，鮑曼不動(dòng)桿菌株中篩到陽(yáng)性菌株8株，大腸桿菌中篩到陽(yáng)性菌株2株，blaNDM-1基因陽(yáng)性菌株體外藥敏實(shí)驗(yàn)顯示， blaNDM-1基因陽(yáng)性菌株對(duì)大多數(shù)的抗生素的耐藥率都超過(guò)了50％，尤其是對(duì)耐碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥率非常

7、高。改良Hodge實(shí)驗(yàn)提示有1735株碳青霉烯抗生素不敏感菌株中出現(xiàn)512株陽(yáng)性。54株blaNDM-1基因陽(yáng)性菌株的臨床資料顯示其來(lái)自43位患者，住院科室主要分布在燒傷科、呼吸科、ICU；主要標(biāo)本來(lái)源于痰液、尿液、血液。
　　2、A組和B組對(duì)絕大多數(shù)抗生素表現(xiàn)出非常高的耐藥率，C組對(duì)大部分抗生素的耐藥率均較低，其中A組與B組統(tǒng)計(jì)分析比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的抗生素為亞胺培南、阿米卡星、左亞氟沙星；耐碳青霉素類(lèi)抗生素菌株（A+B組）和對(duì)

8、碳青霉素類(lèi)抗生素敏感菌株（C組）單因素分析，得出以下方面具有差異性：住院時(shí)間、分離出該菌株前兩個(gè)月內(nèi)應(yīng)用廣譜抗菌藥物大于7天、從外院轉(zhuǎn)入、分離出該菌株前14天內(nèi)使用過(guò)抗生素類(lèi)藥物、發(fā)熱峰值（平均℃）、抗生素使用種類(lèi)、治療中使用替加環(huán)素、好轉(zhuǎn)出院（%）、治療失?。?）和自動(dòng)出院（%），并進(jìn)行多因素Logstic回歸分析得出分離出該菌株前兩個(gè)月內(nèi)應(yīng)用廣譜抗菌藥物大于7天和分離出該菌株前14天內(nèi)使用過(guò)抗生素類(lèi)藥物是耐碳青霉烯類(lèi)抗生素菌株的獨(dú)立

9、危險(xiǎn)因素；對(duì)A組和B組進(jìn)行單因素分析，既往使用碳青霉素類(lèi)抗生素和發(fā)生感染到死亡的時(shí)間具有差異性，并進(jìn)行多因素Logstic回歸分析得出既往使用碳青霉烯類(lèi)抗生素史為碳青霉烯類(lèi)耐藥菌NDM-1質(zhì)粒獲取的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　3、含 blaNDM-1基因菌株直接提取的質(zhì)粒和大腸 J53菌株進(jìn)行接合的質(zhì)粒，進(jìn)行 Southern blot雜交顯色，均證實(shí) blaNDM-1基因大部分存在于質(zhì)粒中，且含blaNDM-1基因菌株與大腸J53菌株進(jìn)

10、行質(zhì)粒結(jié)合成功率為50%，提示攜帶NDM-1基因的質(zhì)?？梢愿咝У卦谀c桿菌科類(lèi)細(xì)菌之間發(fā)生轉(zhuǎn)移，為細(xì)菌的耐藥流行播散提供了傳播載體。將5株經(jīng)接合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的質(zhì)?；蚪M建庫(kù)成功后，進(jìn)行質(zhì)粒測(cè)序質(zhì)量評(píng)價(jià)和基因組拼裝，共得到2個(gè)完整的質(zhì)?；蚪M序列，即 p12和p11106。選取7個(gè)物種的相關(guān)質(zhì)粒序列，分別通過(guò)Mauve軟件與的質(zhì)粒序列做相似性圖。通過(guò)上述基因環(huán)境比較，發(fā)現(xiàn)：1、p11106和p12質(zhì)粒與pNDM-BTR非常相似；2、p11106

11、、p12質(zhì)粒和另外六個(gè)質(zhì)粒存在包含（orf00032-orf00043）20-30kb區(qū)域的差異；3、 NDM-1基因位于（orf00032-orf00043）的中間位置，區(qū)域的上端的有兩個(gè)tnpA基因，以及在其下游發(fā)現(xiàn)36kb區(qū)域的orf00052(tnpA)。
　　結(jié)論：
　　1、blaNDM-1基因在區(qū)域性醫(yī)院存在一定的耐藥流行，在我院以肺炎克雷伯桿菌為主；提示肺炎克雷伯桿菌在blaNDM-1基因的傳播過(guò)程中起到了重要

12、作用，可能是blaNDM-1基因的保存宿主；
　　2、碳青霉烯類(lèi)耐藥菌 NDM-1質(zhì)粒獲取的危險(xiǎn)因素為既往有碳青霉素類(lèi)抗生素使用史；
　　3、p11106和p12質(zhì)?？赡芫哂衟NDM-BTR質(zhì)粒的特征，含NDM-1質(zhì)粒存在orf00032-orf00043差異性，且具有多態(tài)性，NDM-1基因位于orf00032-orf00043的中間位置，聯(lián)系上端的兩個(gè)tnpA基因和下游36kb區(qū)域的orf00052(tnpA)，提示NDM