碳青霉烯不敏感大腸桿菌分子特征及NDM-1適應(yīng)性代價研究.pdf

1、碳青霉烯類抗生素是在人醫(yī)臨床上能夠有效治療由攜帶超廣譜β內(nèi)酰胺酶或頭孢西丁酶腸桿菌引起的嚴重感染的最重要的藥物之一，但是，隨著碳青霉烯類抗生素在人醫(yī)臨床上的應(yīng)用不斷增加，碳青霉烯類抗生素耐藥腸桿菌也呈現(xiàn)出不斷增長的態(tài)勢。腸桿菌產(chǎn)生對碳青霉烯抗生素的耐藥主要原因就是獲得外源性的碳青霉烯酶，其中KPC型和NDM型碳青霉烯酶是目前流行最廣的兩種。大腸桿菌是人醫(yī)臨床和獸醫(yī)臨床上最常見的腸桿菌之一，也是條件性致病菌和體內(nèi)共生菌，其所帶來的危害是十

2、分嚴重的，近年來碳青霉烯耐藥大腸桿菌在人醫(yī)臨床上的報道有逐年增加的趨勢。目前對于碳青霉烯耐藥大腸桿菌的研究多集中在人醫(yī)臨床上，對動物源和環(huán)境源大腸桿菌碳青霉烯耐藥流行病學(xué)調(diào)查缺乏研究資料。適應(yīng)性代價是指細菌為適應(yīng)環(huán)境條件變化而做出的改變，耐藥性的持續(xù)和擴散與適應(yīng)性代價有關(guān)，多數(shù)研究表明細菌獲得耐藥性后，與敏感菌相比其生長力、毒力、穩(wěn)定性會發(fā)生變化，這種變化決定了其能否在宿主體內(nèi)或體外環(huán)境中長久存在。本實驗對分離自豬源和水源碳青霉烯類抗生

3、素不敏感大腸桿菌進行耐藥分子特征的研究，并研究了blaNDM-1基因在大腸桿菌內(nèi)的適應(yīng)性代價。
　　本實驗收集了2009年至2014年分離自黑龍江不同地區(qū)規(guī)模化豬場的豬源大腸桿菌488株和2013年至2014年分離自哈爾濱市馬家溝河水源大腸桿菌105株，運用微量肉湯稀釋法測定了593株大腸桿菌對22種抗菌藥物的MIC值。藥敏試驗結(jié)果顯示，豬源和水源大腸桿菌的耐藥性都比較嚴重，多重耐藥菌普遍存在，其中對阿莫西林、四環(huán)素和復(fù)方新諾明的

4、耐藥率都超過了90％，兩種來源大腸桿菌除了在對阿莫西林/克拉維酸、頭孢噻呋、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢他啶、氨曲南、亞胺培南、美羅培南、厄他培南、氟苯尼考、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、多粘菌素和替加環(huán)素的耐藥率有顯著性差異外，對其他抗生素耐藥率沒有顯著性差異。通過MIC值篩選出對碳青霉烯類抗生素厄他培南、亞胺培南和美羅培南不敏感大腸桿菌40株，其中豬源大腸桿菌22株，水源大腸桿菌18株，水源大腸桿菌對厄他培南、亞胺培南和美羅培南三種碳青霉烯類抗生

5、素的MIC50值和MIC90值都大于豬源大腸桿菌，說明水源大腸桿菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥性比豬源大腸桿菌嚴重。
　　運用改良Hodge試驗和EDTA協(xié)同試驗，對40株碳青霉烯不敏感大腸桿菌進行表型篩選，結(jié)果顯示12株大腸桿菌改良Hodge試驗陽性，5株大腸桿菌EDTA協(xié)同試驗陽性，說明12株菌為疑似產(chǎn)碳青霉烯酶菌，5株菌為產(chǎn)金屬酶菌。
　　PCR方法擴增40株碳青霉烯不敏感大腸桿菌中有可能存在的碳青霉烯酶基因（blaBIC

6、、blaKPC、 blaIMP、blaVIM、blaNDM、blaGIM、blaSPM、blaSIM、blaAIM、blaDIM、blaOXA-48）、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因（blaTEM、blaSHV、 blaCTX-M、 blaCTX-M-1組、blaCTX-M-2-組、 blaCTX-M-8組、blaCTX-M-9-組、blaCTX-M-25-組、 blaOXA）、AmpC酶基因（blaMOX、 blaCMY、blaDHA、bla

7、ACC、blaEBC、blaFOX）、質(zhì)粒介導(dǎo)的16SrRNA甲基化酶基因（armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、rmtE和npmA）和質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因(qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qepA、oqxAB、aac(6')-Ib-cr）。結(jié)果顯示，40株大腸桿菌中，5株菌中檢出blaKPC基因，5株菌中檢出blaNDM基因，經(jīng)過測序確定了兩種基因的亞型分別為blaKPC-2和blaNDM-1，其他類

8、型的碳青霉烯酶基因沒有檢出;40株碳青霉烯酶不敏感大腸桿菌中全部擴增出了超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因，其中以blaCTX-M基因的檢出率為最高，檢出率為95％(38/40)，共檢出12種超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因分別為blaTEM-52、blaSHV-11、blaSHV-12、blaCTX-M-3、blaCTX-M-15、blaCTX-M-55、 blaCTX-M-4、blaCTX-M-14、blaCTX-M-27、blaCTX-M-65、 bl

9、aCTX-M-125和blaOXA-1基因，其中blaTEM-52基因是首次在豬源大腸桿菌中檢出;11株碳青霉烯不敏感大腸桿菌中檢出了AmpC酶基因，并且擴增出的都是blaCMY基因，其他五種AmpC酶基因沒有擴增到，經(jīng)過測序得到了兩種基因亞型分別為blaCMY-2和blaCMY-30;40株碳青霉烯不敏感大腸桿菌中16株檢出質(zhì)粒介導(dǎo)的16SrRNA甲基化酶基因，其中9株檢出armA基因，7株檢出rmtB基因;40株碳青霉烯不敏感大腸桿

10、菌中質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因的檢出率為82.5％(33/40)，其中oqxAB、qnrS、aac(6')-Ib-cr、qepA基因的檢出率分別為55％(22/40)、40％(16/40)、37.5％(15/40)和22.5％(9/40)。
　　運用脈沖場凝膠電泳分型、多位點等位基因序列分型兩種方法對40株大腸桿菌進行分子分型，結(jié)果顯示通過脈沖場凝膠電泳分型技術(shù)把40株大腸桿菌分成A～S共19個克隆株，除了C型、F型、G型、I型、K

11、型、M型和R型屬于多克隆株外，其他12種克隆菌株都屬于單一克隆，證明豬源和水源碳青霉烯不敏感大腸桿菌以單克隆傳播為主，其中5株產(chǎn)KPC-2酶大腸桿菌分成5個克隆株，5株產(chǎn)NDM-1酶大腸桿菌分為4個克隆株;通過多位點等位基因序列分型方法將40株大腸桿菌分成了15個ST型，其中除了包括CC10、CC23、CC38和CC405共4個克隆復(fù)合體外，其他11個ST型都屬于單一序列型，攜帶KPC-2酶大腸桿菌屬于ST69、ST131、ST405、

12、ST410和ST648五種不同的ST型，攜帶NDM-1大腸桿菌屬于ST72、ST131、ST167和ST410四種不同的ST型。運用系統(tǒng)發(fā)育群分組分型方法對40株碳青霉烯不敏感大腸桿菌進行分型，結(jié)果24株屬于致病力弱的A型和B1型，16株屬于致病力強的B2型和D型，攜帶KPC-2酶大腸桿菌有3株屬于強致病力組，2株屬于弱致病力組，攜帶NDM-1酶大腸桿菌有4株屬于弱致病力組，只有1株屬于強致病力組，同時具備強致病力和強耐藥性的菌株對人醫(yī)

13、臨床是個威脅。
　　運用接合實驗的方法驗證碳青霉烯耐藥機制的可轉(zhuǎn)移性，結(jié)果顯示40株碳青霉烯不敏感大腸桿菌中12株接合成功，攜帶KPC-2酶的5株大腸桿菌和攜帶NDM-1的大腸桿菌都接合成功，并在接合子中擴增到了相應(yīng)的基因，證明了blaKP C-2基因和blaDM-1基因位于質(zhì)粒上可以水平移動，在接合成功的產(chǎn)KPC-2酶接合子中擴增到了兩種質(zhì)粒復(fù)制子分別為IncN和IncA/C，在產(chǎn)NDM-1酶接合子中也擴增到了兩種質(zhì)粒復(fù)制子分別

14、為IncA/C和IncFⅡ，證明是這三種質(zhì)粒介導(dǎo)了blaKPC-2基因和blaNDM-1的水平傳播。
　　采用引物步移法對5株產(chǎn)NDM-1酶大腸桿菌中的blaNDM-1基因周圍環(huán)境進行分析，結(jié)果顯示blaNDM-1基因具有三種不同的基因環(huán)境，其中一種基因環(huán)境和鮑曼不動桿菌中blaNDM-1基因環(huán)境完全吻合，證明耐藥質(zhì)粒在腸桿菌和鮑曼不動桿菌之間發(fā)生了傳遞，另外兩種是典型的腸桿菌中blaNDM-1基因環(huán)境特征。
　　體外構(gòu)建含