蟲(chóng)媒病毒和呼吸道病毒Array-ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、背景:蟲(chóng)媒病毒是一些通過(guò)吸血節(jié)肢動(dòng)物叮咬敏感脊椎動(dòng)物而引起的自然疫源性疾病及人獸共患病的一群病毒，包括14個(gè)病毒科，500多種病毒，其中130余種可引起人、畜疾病，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、皮疹、關(guān)節(jié)痛、出血熱和腦炎等。近年來(lái)，隨著人類活動(dòng)范圍擴(kuò)大和全球氣候變暖，蟲(chóng)媒病毒疫源地逐漸擴(kuò)大，人類與媒介的接觸機(jī)會(huì)增加。在全球范圍內(nèi)，蟲(chóng)媒病毒的傳播和流行程度不斷擴(kuò)大，新發(fā)的蟲(chóng)媒病毒層出不窮，對(duì)人類健康造成巨大的威脅。我國(guó)幅員遼闊，自然環(huán)境復(fù)雜，蟲(chóng)媒病毒宿

2、主種類多、分布廣，是多種蟲(chóng)媒病毒的自然疫源地，蟲(chóng)媒病毒是我國(guó)公共衛(wèi)生安全的重大威脅。呼吸道病毒指主要以呼吸道為侵入門(mén)戶，首先在呼吸道粘膜上皮細(xì)胞中增殖引起呼吸道以及全身感染，造成呼吸道及其他器官損害的病毒的總稱。呼吸道病毒包括正粘病毒科、副粘病毒科、披膜病毒科、小RNA病毒科、腺病毒科和皰疹病毒科的200余種病毒。呼吸道病毒通過(guò)氣溶膠和飛沫形式傳播，傳播能力強(qiáng)，人感染后發(fā)病急，往往導(dǎo)致群體性爆發(fā)，歷史上呼吸道病毒曾多次引起世界大流行，給

3、人類社會(huì)帶來(lái)了巨大的災(zāi)難。世界衛(wèi)生組織將呼吸道感染列為全球范圍內(nèi)導(dǎo)致5歲以下兒童死亡的第二大誘因，臨床上的急性呼吸感染中有90～95％由呼吸道病毒引起。Array-ELISA是華大吉比愛(ài)開(kāi)發(fā)的一種將經(jīng)典ELISA技術(shù)和現(xiàn)代的芯片技術(shù)相結(jié)合的新技術(shù)，具有高特異性、高靈敏度和高通量的特點(diǎn)。Array-ELISA方法將多種抗原或抗體通過(guò)非接觸式點(diǎn)樣點(diǎn)制在96孔板的每個(gè)微孔中形成陣列，其反應(yīng)原理和操作步驟與ELISA相同，最后采用電化學(xué)發(fā)光和高

4、靈敏的電荷耦合器件感應(yīng)器結(jié)合，將反應(yīng)信號(hào)放大，通過(guò)配套軟件讀取反應(yīng)結(jié)果并輸出。Array-ELISA方法中捕獲陣列每點(diǎn)所需的點(diǎn)樣體積30nL，僅為ELISA包被體積的1/3000，卻具有和ELISA相當(dāng)?shù)撵`敏度。蟲(chóng)媒病毒和呼吸道病毒這兩類病毒不僅傳播廣泛、傳染性強(qiáng)、致病性強(qiáng)，其導(dǎo)致的臨床癥狀相似，往往難以鑒別診斷，病原體的快速準(zhǔn)確檢出是采取正確治療方法和有效防制措施的基礎(chǔ)，本研究擬分別以6種蟲(chóng)媒病毒和5種呼吸道病毒為檢測(cè)對(duì)象，以Arra

5、y-ELISA作為技術(shù)平臺(tái)，建立高特異性、高靈敏度和高通量的檢測(cè)方法。
　　方法:以乙型腦炎病毒、蜱傳腦炎病毒、登革病毒2型、登革病毒4型、東部馬腦炎病毒和辛德比斯病毒6種蟲(chóng)媒病毒病毒，以及甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒和副流感病毒5種呼吸道病毒為檢測(cè)對(duì)象，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)法培養(yǎng)待檢病毒，采用TCID50法對(duì)待檢病毒進(jìn)行滴定，復(fù)蘇雜交瘤細(xì)胞制備單克隆抗體并純化，通過(guò)ELISA和IFA對(duì)單克隆抗體的特異性和靈敏度進(jìn)行

6、初步鑒定，通過(guò)夾心ELISA優(yōu)化捕獲抗體和檢測(cè)抗體配對(duì)，對(duì)檢測(cè)抗體進(jìn)行生物素標(biāo)記，將捕獲抗體通過(guò)非接觸點(diǎn)樣點(diǎn)到96孔板每個(gè)微孔形成Array-ELISA陣列，優(yōu)化捕獲抗體和檢測(cè)抗體的濃度和反應(yīng)條件，使用病毒培養(yǎng)物對(duì)檢測(cè)體系特異性和穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證，使用梯度稀釋的病毒培養(yǎng)液對(duì)建立的Array-ELISA檢測(cè)方法進(jìn)行靈敏度測(cè)定。
　　結(jié)果:1.通過(guò)腹水制備并純化獲得了針對(duì)6種腦炎病毒的9株單克隆抗體，對(duì)單克隆抗體的特異性和靈敏度進(jìn)行了鑒

7、定并標(biāo)記生物素，對(duì)捕獲抗體和檢測(cè)抗體配對(duì)進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定了4D5、2B5、2B8、4F9、1F1和4E11這6株分別針對(duì)乙型腦炎病毒、蜱傳腦炎病毒、登革病毒2型、登革病毒4型、辛德比斯病毒和東部馬腦炎病毒的單克隆抗體同時(shí)作為捕獲抗體和檢測(cè)抗體，捕獲抗體濃度分別為0.025mg/mL、0.025mg/mL、0.05mg/mL、0.2mg/mL、0.05mg/mL、0.05mg/mL，檢測(cè)抗體濃度分別為0.002mg/mL、0.001m

8、g/mL、0.012mg/mL、0.002mg/mL、0.006mg/mL、0.008mg/mL時(shí)具有良好的特異性和靈敏度，以此條件建立Array-ELISA檢測(cè)方法對(duì)乙型腦炎病毒、蜱傳腦炎病毒、登革病毒2型、登革病毒4型、東部馬腦炎病毒和辛德比斯病毒的檢測(cè)靈敏度分別為3.1×103TCID50/mL、3.1×103TCID50/mL、3.1×103TCID50/mL、1.3×104TCID50/mL、1.3×104TCID50/mL和

9、2.5×104TCID50/mL;2.購(gòu)買了針對(duì)5種呼吸道病毒的5對(duì)單克隆抗體分別作為捕獲抗體和檢測(cè)抗體，對(duì)這些單克隆抗體的特異性和靈敏度進(jìn)行了鑒定，將檢測(cè)抗體標(biāo)記生物素，對(duì)捕獲抗體和檢測(cè)抗體濃度進(jìn)行了優(yōu)化，針對(duì)甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒和副流感病毒3型的捕獲抗體A108、B12、8C5、8C4和C65467M的濃度分別為0.025mg/mL、0.1mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mL和0.1mg/m

10、L，檢測(cè)抗體A245、B27、9C5、1E11和C65329M的濃度分別為0.005mg/mL、0.0014mg/mL、0.02mg/mL、0.02mg/mL和0.024mg/mL時(shí)具有良好的特異性和靈敏度，以此條件建立的Array-ELISA檢測(cè)方法對(duì)甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒和副流感病毒3型的靈敏度分別為3.1×102TCID50/mL、1.3×103TCID50/mL、5×103TCID50/mL、2.5×