快速核酸檢測(cè)常見呼吸道RNA病毒方法的建立及臨床應(yīng)用研究.pdf

1、呼吸道病毒是在世界范圍內(nèi)引起呼吸道疾病的常見原因之一?？梢鸬募膊“◤钠胀ǖ纳虾粑栏腥镜絿?yán)重的系統(tǒng)性疾病直至死亡。經(jīng)調(diào)查顯示：流感病毒甲、乙型(influenza virus A，IFA：influenza virus B，IFB)，副流感病毒1、3型(parainfluenza virus 1，PIV1；parainfluenza virus 3，PIV3)，呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，

2、RSV)、人類鼻病毒(human rhinovirus，hRV)和人類柯薩奇病毒(human coxsackievirus，hCV)可導(dǎo)致絕大多數(shù)的病毒性呼吸道感染。嬰幼兒、老年人以及患有嚴(yán)重心肺疾病和免疫缺陷的病人感染這些病毒之后極易引發(fā)各種并發(fā)癥如哮喘，支氣管和肺炎。甲型流感病毒可被進(jìn)一步細(xì)分為16個(gè)血凝素(hemagglutinin，HA)亞型和9個(gè)神經(jīng)氨酸苷酶(neuraminidase，NA)亞型，其中只有H1亞型、H2亞型、

3、H3亞型建立了穩(wěn)定的人類譜系。禽流感病毒是甲型流感病毒中感染禽類的多種甲型流感病毒亞型的總稱，近年來(lái)禽流感中的H5N1，H7N7，H7N3和H9N2屢次發(fā)生感染人的事件，已經(jīng)引起了公共衛(wèi)生當(dāng)局和科學(xué)界的廣泛關(guān)注。目前認(rèn)為抗病毒治療是控制呼吸道病毒流行的手段之一，而早期診斷對(duì)開展有效特異性病原治療有重要意義。 近年來(lái)，基于核酸基礎(chǔ)上的分子診斷在臨床上已占有了重要的地位。本次研究在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain r

4、eaction，PCR)的基礎(chǔ)上，建立了多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法和多重逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)合流過式反向斑點(diǎn)雜交的方法(multiplex Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction combined with Flow-Through Reverse Dot Blotting，mRT-PCR-FT-RDB)用于禽流感病毒和常見呼吸道RNA病毒的快速檢測(cè)。通過優(yōu)化方法，提高了檢測(cè)的

5、靈敏度和特異性，并初步應(yīng)用于臨床資料分析和診斷。目的：建立一種多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)禽流感病毒的方法，達(dá)到敏感且特異地同時(shí)檢測(cè)禽流感病毒H5亞型和H9亞型的目的。 方法：使用甲型流感病毒株和禽流感病毒株的RNA建立多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)方法。針對(duì)甲型流感病毒共有的Matrix基因和亞型特異性基因H5基因和H9基因設(shè)計(jì)引物和Taqman探針，并將其應(yīng)用于一次多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)中，以達(dá)到同時(shí)檢測(cè)三種熒光信號(hào)的目的。

6、使用標(biāo)準(zhǔn)病毒株和陽(yáng)性質(zhì)粒DNA來(lái)測(cè)定該方法的特異性和靈敏度。用廣州來(lái)源的47例咽拭子標(biāo)本來(lái)評(píng)價(jià)和驗(yàn)證所建立方法在臨床應(yīng)用中的靈敏度和特異性。 結(jié)果：該方法可以同時(shí)檢測(cè)甲型流感病毒包括H5，H9亞型，且靈敏度達(dá)到每反應(yīng)10拷貝。 結(jié)論：多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法可快速、靈敏、特異性地檢測(cè)到包括禽流感病毒亞型H5和H9在內(nèi)的甲型流感病毒。該法操作簡(jiǎn)便，報(bào)告周期短，適用于大規(guī)模的篩查，尤其能在可能發(fā)生的大爆發(fā)中發(fā)揮作用。

7、 背景：由呼吸道病毒引起的臨床癥狀不具有特異性。病毒分離培養(yǎng)和免疫熒光檢測(cè)等傳統(tǒng)檢測(cè)手法敏感度低且費(fèi)時(shí)。 目的：反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)整合最新的流過式雜交原理，為了達(dá)到可以同時(shí)檢測(cè)多種常見呼吸道RNA病毒的目的。 方法：使用標(biāo)準(zhǔn)病毒株建立多重逆轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)合流過式反向斑點(diǎn)雜交的檢測(cè)方法。通過分析Genebank上的序列來(lái)設(shè)計(jì)引物探針。使用標(biāo)準(zhǔn)病毒株的半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(50％tissue culture infective

8、dose，TCID50)來(lái)測(cè)定該方法的靈敏度，并使用其他病毒株來(lái)測(cè)定該法的特異性。通過與金標(biāo)準(zhǔn)比較，用廣州來(lái)源的200例標(biāo)本來(lái)評(píng)價(jià)該方法檢測(cè)臨床標(biāo)本的靈敏度和特異性。 結(jié)果：該檢測(cè)方法的靈敏度為0.01-0.1TCI0D50／ml，并具有很高的特異性。標(biāo)本檢測(cè)表明，該方法與作為金標(biāo)準(zhǔn)的病毒分離培養(yǎng)法和免疫熒光法相比較，靈敏度達(dá)到100％，特異性達(dá)到98％。 結(jié)論：建立的多重逆轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)合流過式反向斑點(diǎn)雜交檢測(cè)呼吸道RN

9、A病毒的方法快速、可靠并且廉價(jià)。相對(duì)于傳統(tǒng)方法來(lái)說，它更適用于臨床應(yīng)用。 背景：建立的多重逆轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)合流過式反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)檢測(cè)呼吸道RNA病毒的方法具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。由于病毒分離培養(yǎng)法的局限性，呼吸道RNA病毒在發(fā)熱病人中的流行病學(xué)特征以及其可能對(duì)臨床表現(xiàn)存在的影響卻鮮見報(bào)道。 目的：研究呼吸道RNA病毒在廣州地區(qū)發(fā)熱病人中的發(fā)病情況及伴隨的相關(guān)臨床癥狀以期尋找在發(fā)展中國(guó)家中與呼吸道病毒相關(guān)的流行病學(xué)特點(diǎn)

10、。望能對(duì)發(fā)熱病人的診斷和治療提供一些線索。 方法：用第二章建立的多重逆轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)合流過式反向斑點(diǎn)雜交方法檢測(cè)了600例來(lái)自發(fā)熱門診中疑似有呼吸道感染的病人的咽拭子標(biāo)本，同時(shí)記錄標(biāo)本資料和臨床資料。對(duì)呼吸道RNA病毒的發(fā)生率和呼吸道RNA病毒相關(guān)的臨床癥狀進(jìn)行分析。 結(jié)果：呼吸道RNA病毒在334例病人中被檢出。通過分析證實(shí)呼吸道RNA病毒在不同年齡和不同性別中的分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而在不同季節(jié)中的分布有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí)，