小兒常見呼吸道感染病毒快速檢測方法的研究.pdf

1、急性呼吸道感染（acute rispiratory infections，ARIs）的發(fā)病率在我國小兒各類疾病中占首位，是兒科的常見病、多發(fā)病。目前，已經(jīng)證實(shí)，兒童急性呼吸道感染中80％以上是病毒感染引起的?？梢鸷粑栏腥镜牟《痉N類很多，至少有7個(gè)病毒科的10多類、共239個(gè)型別的病毒。包括鼻病毒(rhinovirus，RHV)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)、人偏肺病毒(human

2、metapneumovirus，MPV)、A型流感病毒(influenza virus type A，IFA)、B型流感病毒(Iinfluenza virustype B，IFB)、腸道病毒(enterovirus，EV)、副流感病毒1-3型(parainflenza virus type1-3，PIV1-3)、博卡病毒(bocavirus，BoV)、巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus，CMV)、EB病毒(epstein-bar

3、r virus，EB)、麻疹病毒(measles virus，MV)、腺病毒(adenovirus，ADV)、冠狀病毒(coronaviruses，CoV) NL63/229E/OC43/SARS等。呼吸道病毒傳染性強(qiáng)，可以引起局部爆發(fā)和世界大范圍流行，嚴(yán)重影響人類健康。而且同一種病毒可以引起多種的臨床癥狀，不同的病毒也可引起同一種臨床癥狀。因此，病原學(xué)證據(jù)在臨床診治和流行病監(jiān)控中顯得尤為重要。目前的檢測方法，如病毒分離培養(yǎng)、病毒血清學(xué)

4、檢測等方法，已經(jīng)無法滿足臨床上高效、快速和高通量的要求。
　　目的:
　　建立一種可同時(shí)檢測18項(xiàng)小兒常見呼吸道感染病毒的快速檢測方法，并開發(fā)試劑盒。
　　方法:
　　從呼吸道感染如普通感冒、兒童中耳炎、咽炎、肺炎、毛細(xì)支氣管炎、支氣管炎、哮喘等患者或疑似患者的咽拭子或痰液樣本中，經(jīng)磁珠抽提后提取呼吸道病毒的核酸DNA/RNA。使用所得的病毒核酸，建立逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)結(jié)合Taqman探針熒光定量

5、PCR的檢測方法。針對(duì)18項(xiàng)小兒常見呼吸道感染病毒，包括鼻病毒(RHV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、人偏肺病毒(MPV)、A型流感病毒(IFA)、B型流感病毒(IFB)、腸道病毒(EV)、副流感病毒1-3型(PIV1-3)、博卡病毒(BoV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、EB病毒(EB)、麻疹病毒(MV)、腺病毒(ADV)、冠狀病毒(CoV)NL63/229E/OC43/SARS等設(shè)計(jì)引物和Taqman探針。通過測定RT-PCR的Buffer

6、中不同濃度的Tris、K+、NH4+、Mg2+、BSA、甘油、Tween-20和TritonⅩ-100時(shí)各樣本的擴(kuò)增曲線，來選擇Buffer中各種離子的濃度。在混合樣本中，分別加入不同濃度Taq酶、不同濃度的逆轉(zhuǎn)錄酶、不同濃度的引物和探針，其他實(shí)驗(yàn)條件相同，進(jìn)行病毒核酸的擴(kuò)增，檢測其擴(kuò)增曲線，從而選擇Taq酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、引物和探針的合適濃度。將得到的病毒核酸應(yīng)用于一次多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)中，以達(dá)到同時(shí)檢測多種熒光信號(hào)的目的。并與所

7、得的PCR產(chǎn)物純化后直接測序或TA克隆進(jìn)行測序得到的基因測序結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。在湖州市中心醫(yī)院取100例呼吸道病毒患者和100例健康人群的痰液和咽拭子標(biāo)本來評(píng)價(jià)和驗(yàn)證所建立方法在臨床應(yīng)用中的特異性和靈敏度。
　　結(jié)果:
　　通過比較市面上已有的成熟磁珠抽提試劑盒，選取天隆科技生物有限公司的核酸提取試劑盒作為本方法可配套使用的核酸抽提試劑盒。根據(jù)不同濃度質(zhì)控品擴(kuò)增結(jié)果，根據(jù)拷貝數(shù)的計(jì)算方法，計(jì)算得到的濃度將其稀釋，得到各個(gè)稀釋濃度

8、的Ct值，選取Ct位于16-23的質(zhì)控品RNA的作為強(qiáng)陽性質(zhì)控，Ct位于28-35之間的作為弱陽性質(zhì)控。分別測定RT-PCR的Buffer中不同濃度的Tris、K+、NH4+、Mg2+、BSA、甘油、Tween-20和TritonⅩ-100時(shí)各樣本的擴(kuò)增曲線，根據(jù)結(jié)果選擇10mM Tris，55 mM K+、18mM NH4+和6mM Mg2+、0.17mg/mL BSA、5％甘油和0.1％Tween20作為Buffer的最終組成成分。

9、在混合樣本中，加入不同濃度Taq酶，其他實(shí)驗(yàn)條件相同，進(jìn)行病毒核酸的擴(kuò)增，檢測其擴(kuò)增曲線，最終選擇2.5U Taq為最終酶濃度。在混合樣本中，加入不同濃度的逆轉(zhuǎn)錄酶，其他實(shí)驗(yàn)條件相同，進(jìn)行病毒核酸的擴(kuò)增，檢測其擴(kuò)增曲線，從而選擇濃度1的逆轉(zhuǎn)錄酶作為試劑盒逆轉(zhuǎn)錄酶的用量。在混合樣本中，加入不同濃度的引物和探針，其他實(shí)驗(yàn)條件相同，進(jìn)行病毒核酸的擴(kuò)增，檢測其擴(kuò)增曲線，結(jié)合熒光值和Ct值等，選擇合適的引物和探針的濃度。將得到的PCR產(chǎn)物純化后直

10、接測序或TA克隆進(jìn)行測序，核對(duì)序列，與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blast比對(duì)，證實(shí)該基因序列屬于保守區(qū)，且高度特異性，與其它細(xì)菌、病毒等病原體無交叉反應(yīng)，可排除假陽性。將各樣本濃度稀釋至1000 copies/mL左右，對(duì)此濃度的樣本進(jìn)行10次重復(fù)檢測，能夠100％檢出;當(dāng)樣本濃度過低時(shí)（Ct＞34左右），10次PCR重復(fù)檢驗(yàn)不能100％檢出陽性。與感染部位相同或者感染癥狀相似的其他病原體，如水痘帶狀皰疹病毒、單純皰疹病毒、乙型肝炎病毒、丙型

11、肝炎病毒、鏈球菌、金黃色葡萄球菌和肺炎球菌）無交叉反應(yīng)。當(dāng)常見干擾物質(zhì)如血液、膿液、肺炎治療用藥阿莫西林、羅紅霉素和阿奇霉素在檢驗(yàn)樣本中濃度分別是10％、5％、0.2g/L、0.03g/L和0.15g/L時(shí)，不會(huì)影響到對(duì)樣本檢測結(jié)果的判斷。將試劑盒反復(fù)凍融6次后，進(jìn)行檢測的結(jié)果與未經(jīng)過凍融的試劑檢測結(jié)果之間沒有顯著差異。湖州市中心醫(yī)院使用三批本研究開發(fā)、江蘇默樂科技有限公司生產(chǎn)的呼吸道18項(xiàng)病毒核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）對(duì)100例呼

12、吸道病毒患者和100例健康人群的痰液和咽拭子標(biāo)本進(jìn)行核酸檢測，同時(shí)與基因測序結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，得出:試劑盒靈敏度97.98％，特異性98.1％，與測序金標(biāo)準(zhǔn)相比，準(zhǔn)確性達(dá)到98.04％，批間變異系數(shù)＜15％。
　　結(jié)論:
　　1、本研究建立了逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）結(jié)合Taqman探針熒光定量PCR的方法，可快速、靈敏、特異地檢測18項(xiàng)呼吸道病毒的核酸。
　　2、呼吸道18項(xiàng)病毒核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）已經(jīng)