分子診斷技術平臺的建立及其在呼吸道病毒與登革病毒檢測中的應用.pdf

1、目的:
　　1.整合以核酸擴增為原理的各種PCR技術(普通PCR、熒光定量PCR、多重PCR)和高通量基因測序技術，建立既能快速篩查常見病毒，又有能力發(fā)現(xiàn)新發(fā)病毒的臨床病毒檢測體系，滿足醫(yī)療機構(gòu)用于常規(guī)檢驗工作和公共衛(wèi)生單位應對突發(fā)性公共衛(wèi)生事件的需求。
　　2.建立常見呼吸道病毒篩查的多重PCR、病毒宏基因組學高通量基因測序平臺、腺病毒核酸通用及分型PCR檢測體系，探討其在呼吸系統(tǒng)感染病原學診斷上的應用。
　　3.基

2、于2014年廣州發(fā)生的嚴重登革熱疫情，自主建立登革病毒核酸檢測及分型技術體系，分析本次疫情流行的登革病毒型別和基因進化特征、住院患者的臨床表現(xiàn)和實驗室檢測結(jié)果，以了解本次疫情的流行病學特征;比較分子診斷技術和免疫學技術在登革熱臨床診斷中的應用效果，以指導臨床合理選擇檢驗項目。
　　方法:
　　1.呼吸道病毒分子診斷平臺的建立及應用
　　1.1呼吸道病毒多重PCR檢測體系的建立及兒童急性鼻竇炎病毒譜的研究
　　設計

3、一套針對A型流感病毒(IFA)、B型流感病毒(IFB)、1～4型人副流感病毒(HPⅣ)，呼吸道合胞病毒(RSV)，腺病毒(ADV)，鼻病毒(RV)，腸道病毒(EV)，人偏肺病毒(HMPV)，人博卡病毒(HBoV)，冠狀病毒OC43(OC43)，冠狀病毒NL63(CoronavirusNL63)，冠狀病毒229E(Coronavirus229E)共15種常見呼吸道病毒的多重PCR檢測體系，對259份兒科門診急性鼻竇炎(ARS)患兒、219

4、份急性上呼吸道感染(AURI)患兒、86份對照兒童鼻拭子標本進行呼吸道病毒檢測。比較分析ARS組和AURI組患兒鼻部的呼吸道病毒分布情況，分析與急性鼻竇炎的相關性最高的病毒。統(tǒng)計學分析采用卡方檢驗。
　　1.2呼吸道宏基因組高通量測序方法的建立及兒童重癥肺炎病原學的研究
　　建立基于Ion Torrent/Proton平臺的呼吸道宏基因組高通量測序技術，并對9份重癥肺炎患兒肺泡灌洗液(BALF)標本進行宏基因組測序。獲得的測

5、序讀長用BLASTn與GeneBank數(shù)據(jù)庫中的基因組序列進行比對，分析標本中存在的病毒種類及豐度，對標本中微生物的種類進行定性與定量檢測。數(shù)據(jù)量足夠時使用Trinity軟件組裝病毒的全基因組序列，使用TVC和GATK兩種方法進行SNPs及InDel突變的檢測，使用BioEdit7.0和MEGA6.0軟件進一步做毒株的同源進化分析。并比較NGS技術與PCR擴增和傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定結(jié)果的一致性。
　　1.3腺病毒通用及分型PCR檢測方法的

6、建立及各亞型流行特征的研究
　　設計針對腺病毒Hexon基因保守區(qū)的通用引物、探針以及3、4、7、14、21型腺病毒型特異性引物，建立人腺病毒檢測及分型的普通PCR和熒光定量PCR方法，對105份腺病毒核酸檢測陽性的兒童呼吸道感染標本進行基因分型，分析腺病毒各亞型在兒童呼吸道感染疾病中的分布情況。
　　2.登革熱分子診斷技術的建立及評估
　　2.1登革病毒PCR檢測體系的建立及廣州登革疫情的流行病學研究
　　設計

7、1～4型登革病毒通用及型特異性的普通PCR和熒光定量PCR引物、探針，建立登革病毒核酸檢測及分型體系。并對2014年9月20日至2014年11年20日間于廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院確診的登革熱住院患者的血清標本進行登革病毒檢測及分型，對病毒分離株的E、NS1基因序列做進化分析，開展登革病毒分子流行病學研究。
　　2.2登革熱分子診斷與免疫學檢驗方法的比較
　　根據(jù)WHO診斷標準，收集138名登革熱確診住院患者的254份血清樣本

8、，并進行病毒核酸（熒光定量PCR技術）和登革病毒NS1抗原(ELISA)、特異性抗體（層析免疫分析法）檢測。對診斷登革熱的分子生物學與免疫學方法進行比較，觀察不同檢測指標在病程中的變化規(guī)律，為合理使用登革熱實驗室診斷項目提供依據(jù)。
　　2.32014年廣州登革熱住院患者臨床特征與檢驗結(jié)果的分析
　　收集138名登革熱住院患者的臨床資料，按照其感染的登革病毒血清型、發(fā)病程度（普通或重癥登革熱）進行分組，比較不同組間皮疹、肌肉痛

9、、惡心嘔吐、腹痛腹瀉等癥狀，白細胞、血小板、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、乳酸脫氫酶、肌酸激酶等多項臨床檢驗指標的差異及其在發(fā)病期間的動態(tài)變化規(guī)律。
　　成果:
　　1.呼吸道病毒分子診斷整合平臺的建立及應用
　　1.1呼吸道病毒多重PCR檢測體系的建立及兒童急性鼻竇炎病毒譜的研究
　　使用呼吸道多重PCR篩查體系從564份鼻拭子標本中檢出179株(31.7％)病毒，ARS組(44.4％)、AURI組(27.4％)和對

10、照組(4.7％)各組之間病毒檢出率的差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001，RR=2.116，95％CI=1.440～3.110)。RV的檢出率最高，在ARS組中有24例(9.3％)，AURI組中9例(4.1％)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，RR=2.27);另外ARS組檢出腺病毒16例(6.2％)，AURI組4例(1.6％)(P＜0.05，RR=3.374)，其余病毒在兩組之間的檢出率無統(tǒng)計學差異。
　　1.2呼吸道宏基因組高通量

11、基因測序方法的建立及兒童重癥肺炎病原學的研究
　　成功利用呼吸道宏基因組高通量測序技術對重癥肺炎患者BALF標本進行病原檢測，結(jié)果顯示每份標本中病毒、真菌、細菌的讀長序列所占比例各不相同。檢測出的主要病原體有7例ADV-7，其中一例是ADV-7和HPⅣ混合感染，MPV和H3N2甲型流感病毒各1例，同時共存有多種低豐度的其他病毒，如RSV, TT病毒，HPV, EBV,沙門達病毒。通過拼接與組裝獲得了4例7型ADV型病毒全基因組序列

12、，相互之間相似度＞99.7％，且與近年來我國各地報道的7型腺病毒序列均高度相似(＞98.1％)。PCR擴增結(jié)果為7例ADV、MPV和A型流感病毒各1例，與宏基因組測序結(jié)果基本一致，但漏檢了混合感染中的HPⅣ。
　　宏基因測序檢測結(jié)果除去大量正常菌群外，檢出副流感嗜血桿菌、流感嗜血桿菌、黏液羅斯菌、大腸桿菌等;檢出2例肺炎支原體(MP)和1例熱帶假絲酵母菌，與培養(yǎng)鑒定結(jié)果基本相同，但宏基因測序可獲得的細菌種類更全面，易發(fā)現(xiàn)兩種或兩種

13、以上細菌混合感染。而在真菌鑒定方面，宏基因測序漏檢了1例白色假絲酵母菌，培養(yǎng)鑒定方法則誤將熱帶假絲酵母菌鑒定為釀酒酵母。
　　1.3腺病毒通用及分型PCR檢測方法的建立及各亞型流行特征的研究
　　本節(jié)設計的ADV通用PCR引物及探針，型特異性分型引物均能擴增特異性產(chǎn)物，不同型之間無交叉反應。105份陽性核酸標本使用熒光定量PCR檢測均為陽性，而普通PCR只能檢測出87例(82.9％)。使用分型PCR對80份標本進行了腺病毒分

14、型，其中ADV-3型檢出率最高共有50例(57.5％)、其次ADV-7型23例(26.4％)、ADV4型5例(5.7％)、ADV14型和21型各1例，分別占1.1％。但重癥肺炎患者中ADV-7型(66.7％)的檢出率高于ADV-3型(33.3％)。
　　2.登革熱分子診斷技術的建立及評估
　　2.1登革病毒PCR檢測體系的建立及廣州登革疫情的流行病學研究
　　本實驗最終納入了138名登革熱住院患者，其中124例(89.

15、9％)核酸檢測陽性，DENV-1型107例(77.5％)，DENV-2型17例(12.3％)。流行病毒株的E、NS1基因進化分析結(jié)果表明DENV-1和DENV-2毒株都與廣東省2006至2013年間流行的病毒株高度相似(＞99％)。
　　2.2登革熱分子診斷與免疫學檢驗方法的比較
　　以首次發(fā)熱時間為病程第一天，vRNA核酸檢測陽性率在前五天均為100％，七天內(nèi)可維持在80％以上。NS1抗原檢測的陽性率在第三至第九天持續(xù)維持

16、在90％以上。IgM抗體在第六日開始升高至80％; IgG抗體前8天陽性率在20％以下，后續(xù)可穩(wěn)定保持在80％以上。vRNA與NS1抗原檢測在八天內(nèi)的聯(lián)合診斷率達到100％; NS1抗原和抗體檢測在第七至十天的聯(lián)合診斷率為100％。
　　2.3廣州登革熱住院患者臨床特征與檢驗結(jié)果的分析
　　所有登革熱患者均會出現(xiàn)高熱，其中約52.2％的患者出現(xiàn)肌肉、骨關節(jié)疼痛，31.2％出現(xiàn)明顯皮疹，(20～30)％的患者伴有不同程度的消化

17、道癥狀，如惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等;病情嚴重者常出現(xiàn)意識障礙，多器官功能障礙，甚至休克、死亡。白細胞和血小板計數(shù)都有明顯降低趨勢，白細胞均值在第五天降至最低值(2.85±1.6)/L，血小板均值在第七天左右到達最低(78±51.8)/L，ALT、AST、CK、LDH、D-Dimer在感染期間有升高趨勢，大部分患者的血Bun、Cr水平在感染期間無明顯變化。1、2型登革病毒感染患者的各項臨床癥狀的發(fā)生率與檢驗結(jié)果均無統(tǒng)計學差異。而8例(5.

18、8％)重癥登革熱患者中有6人(75％)出現(xiàn)意識障礙，2人(25％)出現(xiàn)休克，2人(25％)死亡。重癥登革熱組的平均住院時間(18.6±9.5天)及實驗室檢驗結(jié)果包括:PLT(29.6±27.2)/L、ALT(138.3±164.6) U/L、 AST(179.5±117.5)U/L、 CK(1969.6±3821.5)U/L、LDH(2743.3±6148.4)U/L、D-Dimer(5113.7±3962.9)ng/ml、Cr(276

19、.4±426.6)umol/L、BUN(10.0±7.5)mmol/L與普通登革熱患者組的結(jié)果相比均有顯著的統(tǒng)計學差異。
　　結(jié)論:
　　1.呼吸道病毒分子檢測體系的建立與應用研究
　　本課題建立了中低通量的呼吸道病毒多重PCR篩查體系，能經(jīng)濟、快速的擴增15種常見的呼吸道病毒，不僅可以滿足臨床常規(guī)檢測的需要，更是應對突發(fā)傳染病快速篩查病原體的重要工具，當常規(guī)檢測無法找到明確的病原體時，建立的宏基因組測序方法將以其不依

20、賴特異性擴增的技術特點，及時檢測出新發(fā)、再現(xiàn)的或者發(fā)生明顯變異的病毒，同時還能獲得標本中所有微生物種類及相對含量、從原位標本中獲得病毒全基因組序列及毒株突變位點的信息，在臨床病毒的診斷、研究，急性突發(fā)性傳染病的檢測和監(jiān)控等方面都用重要的應用前景。
　　本課題應用該檢測體系發(fā)現(xiàn)感染呼吸道病毒會增加兒童患鼻竇炎的幾率，其中RV和ADV與兒童急性鼻竇炎的發(fā)病關系最緊密。兒童重癥肺炎病原學的研究結(jié)果顯示，ADV-7型是主要的病原體，并且易

21、引起細菌、真菌或MP的混合感染，ADV-7基因序列保守，本次獲得的四株7型腺病毒高度相似，結(jié)合我國多地的病例報道，提示ADV-7引起的重癥感染在我國多地散發(fā)。但是，通過自主建立的腺病毒通用及分型PCR核酸檢測體系對各亞型腺病毒的流行特點的分析，發(fā)現(xiàn)廣州地區(qū)腺病毒的流行主要以3型為主，但在重癥肺炎病例中ADV-7型的陽性率明顯高于3型。7型腺病毒在下呼吸道的致病性可能高于上呼吸道，是引起兒童重癥肺炎極為重要和關心的病原體，但其關鍵性的致病

22、因素尚未研究清楚。
　　2.登革熱分子診斷技術的建立及評估
　　本課題初步建立了登革病毒PCR及熒光定量PCR通用檢測及分型體系，通過核酸分型檢測以及對E、NS1基因序列的進化分析，發(fā)現(xiàn)此次疫情共有兩型登革病毒(DENV-1，DENV-2)流行，兩種血清型的毒株都與廣東省近年來的多株病毒十分接近。經(jīng)過多年散發(fā)流行和輸入病例的積累，廣東可能已經(jīng)形成了DENV-1，DENV-2的地方性傳播。2014年廣州登革疫情中由1、2型DE

23、NV感染的病例在臨床表現(xiàn)上無差異，而重癥登革熱患者相較普通患者血小板降低更加顯著，出現(xiàn)明顯的心、肝、腎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能損傷，需要更長時間進行住院治療，各種檢驗結(jié)果對登革熱患者病情程度的判斷有重要作用，可幫助患者及時獲得對癥治療，降低病死率。
　　核酸檢測是登革熱早期診斷最佳的方法。NS1在早期的靈敏度略低于核酸檢測，但持續(xù)的時間較長。而抗體檢測則在病程后期有重要的診斷作用。以患者首次發(fā)熱作為病程第一天，八天內(nèi)建議采用核酸檢測結(jié)合