Ⅱ型登革病毒NS1抗原捕獲方法建立及其在登革病毒感染分型診斷中的應(yīng)用.pdf

1、登革熱是一種由白紋伊蚊和埃及伊蚊傳播的疾病，自70年代以來，由于蚊媒控制難度大、全球氣候變暖、病毒進(jìn)化和國際間人員流動(dòng)增多等諸多因素的影響，登革病毒（DENV）的傳播范圍顯著增加。DENV已知有四個(gè)血清型（DENV1、DENV2、DENV3和DENV4），任何一種DENV感染均可導(dǎo)致登革熱、登革出血熱（DHF）或登革休克綜合征（DSS），而不同血清型的登革病毒二次感染是引發(fā)DHF和DSS的高危因素。由于機(jī)體對不同血清型DENV感染的免疫

2、保護(hù)作用只是部分的和短暫的，所以生活在疫區(qū)的人們在一生中均可能受到四種血清型DENV感染的威脅。因此，在一個(gè)地區(qū)內(nèi)各型DENV的反復(fù)流行是導(dǎo)致出現(xiàn)此病嚴(yán)重形式DHF和DSS最常見的危險(xiǎn)因素。目前，對DENV感染的早期診斷和分型診斷以及區(qū)分其他相關(guān)的黃熱病毒感染中，分子診斷技術(shù)（RT-PCR）在很大程度上代替了傳統(tǒng)的病毒分離方法。雖然分子檢測提供了一種較理想的敏感而快速的診斷，但此方法成本高，且需要專門的實(shí)驗(yàn)設(shè)備和熟練的技術(shù)人員，這些因素

3、局限了其在登革熱流行的許多發(fā)展中國家的使用。 操作簡單、快速準(zhǔn)確且成本低的病毒抗原檢測方法能很好地克服RT-PCR的缺點(diǎn)，并已成功地應(yīng)用于感染性疾病的診斷和監(jiān)測。DENV包含有3個(gè)主要的結(jié)構(gòu)蛋白（C，prM，and E）和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B，和NS5）。在這些蛋白中，NS1是相對保守的糖蛋白，其分子量為45-50Kda，以膜型和分泌型兩種形式高表達(dá)于感染的細(xì)胞中。雖然NS1的確

4、切功能尚不清楚，但它是一個(gè)被研究較多的診斷靶標(biāo)抗原。近來，已有兩種DENVNS1抗原捕獲ELISA成為商品化的DENV感染的早期診斷試劑，這兩種診斷試劑準(zhǔn)確性好、敏感性高，能快速而可靠的診斷DENV急性期初次感染和二次感染。然而，這些方法的局限性在于其使用的抗體是針對四個(gè)血清型的DENV和蟲媒病毒的交叉抗原表位的，不能區(qū)分DENV血清型。研究表明NS1具有群特異性和型特異性，因此特異性針對NS1抗原的單抗產(chǎn)品有望發(fā)展成為群特異性和型特異

5、兼有的抗原檢測試劑。在前期研究中，我們制備了一組特異性識(shí)別DENV1 NS1抗原表位的單抗并成功地建立了檢測DENV1 NS1抗原捕獲ELISA，此方法已被證明為早期檢測和快速鑒定DENV1感染的有效工具。本研究中，我們制備了一組特異性針對DENV2 NS1抗原的單抗，并建立了DENV2型特異性NS1抗原捕獲ELISA，并對其在DENV感染早期診斷和分型診斷中的作用和意義進(jìn)行了初步的探討。 本研究主要分為三個(gè)部分： 第一

6、部分：DENV2 NS1蛋白特異性單克隆抗體的制備及鑒定。 本部分研究在成功獲得具有良好抗原性的DENV2 NS1蛋白的基礎(chǔ)上，制備抗Ⅱ型登革病毒NS1蛋白特異性單抗，并對單抗進(jìn)行免疫學(xué)特性研究、抗體識(shí)別抗原位點(diǎn)分析以及血清型特異性鑒定。采用重組DENV2 NS1蛋白與滅活的DENV2混合免疫BALB/c小鼠，取血清抗體效價(jià)高的小鼠脾臟與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，并對陽性的細(xì)胞株采用有限稀釋法進(jìn)行克隆化。ELISA檢測初步確定有37株

7、穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞與DENV2 NS1重組蛋白和DENV2感染細(xì)胞裂解上清均有強(qiáng)陽性反應(yīng)。IgG亞類測定表明，37株單抗中IgG2a有1株，IgG2b有3株，IgG1有33株。Western blot結(jié)果顯示所有的單抗均與DENV2 NS1重組蛋白和DENV2感染細(xì)胞裂解上清呈陽性反應(yīng)，免疫反應(yīng)條帶位置大小約為分子量45KDa。通過四個(gè)血清型DENV的IFA和DENV NS1重組蛋白的ELISA進(jìn)一步鑒定單抗的血清型特異性，結(jié)果顯

8、示，在37株單抗中有20株單抗與DENV2特異性反應(yīng)而與其他三個(gè)血清型的DENV無交叉反應(yīng)，IFA和ELISA的結(jié)果一致；另外17株單抗與四個(gè)血清型DENV存在不同的交叉反應(yīng)模式。采用競爭ELISA用DENV2 NS1重組抗原包被微孔板對20株特異性單抗的抗原結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，20株單抗至少識(shí)別DENV2 NS1蛋白的4個(gè)不同的抗原結(jié)合位點(diǎn)。為下一步建立雙抗體夾心抗原捕獲ELISA奠定了基礎(chǔ)。 第二部分：DENV2 N

9、S1抗原捕獲ELISA的建立。 根據(jù)單抗表位測定結(jié)果，在識(shí)別NS1蛋白不同抗原結(jié)合位點(diǎn)的單抗中進(jìn)行相互配對，以選擇最佳的捕獲單抗和檢測單抗配對建立雙抗體夾心ELISA。結(jié)果顯示，識(shí)別抗原結(jié)合位點(diǎn)Ⅲ的8株單抗和識(shí)別抗原結(jié)合位點(diǎn)Ⅳ的9株單抗中進(jìn)行相互配對檢測DENV2 NS1蛋白的敏感性均較高。最后，我們選擇了以單抗M6（4D41A6）作為固相的捕獲抗體和M14（5A47A8）作為標(biāo)記的檢測抗體的配對組合，其檢測系列稀釋的DENV2

10、感染細(xì)胞培養(yǎng)上清中的NS1抗原的敏感性最高，而檢測一組正常人血清標(biāo)本顯示特異性最好。建立的雙抗體夾心抗原捕獲法檢測重組NS1蛋白的靈敏度為3ng/mL，其線性檢測范圍為10～100 ng/mL，可用于評價(jià)臨床標(biāo)本中NS1水平。進(jìn)一步檢測不同血清型的DENV和其它黃病毒的病毒培養(yǎng)液，結(jié)果顯示，采用血清型特異性單抗建立的雙抗體夾心抗原捕獲法僅特異的檢測到DENV2，而與其它病毒無交叉反應(yīng)，檢測方法具有型特異性。本部分研究表明，采用雙抗體夾心

11、抗原捕獲法建立的NS1蛋白檢測方法具有高敏感性和特異性，可為登革病毒感染提供一種新的實(shí)驗(yàn)室診斷方法。 第三部分：DENV2 NS1抗原捕獲ELISA初步臨床研究。 通過對DENV和臨床血清樣品的檢測，以及與商品化的進(jìn)口同類產(chǎn)品的比較，探討所建立方法在登革病毒感染早期診斷和分型診斷中的作用。我們所建立方法與商品化的Panbio DENV NS1抗原捕獲ELISA同時(shí)檢測空斑實(shí)驗(yàn)確定病毒滴度的DENV，結(jié)果顯示我們的方法能檢

12、測到的DENV2最高稀釋度為1：4，096（5．8 PFU/0．1ml），商品化的試劑盒能檢測到的DENV2最高稀釋度為1：512（46．8PFU/0．1ml），由此可見，對于DENV2感染細(xì)胞培養(yǎng)上清中NS1的檢測，我們的方法比商品化的Panbio DENV NS1抗原捕獲ELISA敏感性高達(dá)8倍。采用建立的方法檢測了504例正常人血清樣品，確立檢測的臨界值。對504例正常血清樣品的檢測全部為陰性，特異性達(dá)100%。檢測了30份實(shí)驗(yàn)室

13、確診為DENV2感染的病人血清標(biāo)本以確定本方法對臨床標(biāo)本檢測的準(zhǔn)確度。在這些標(biāo)本中，有10份是病毒分離和RT-PCR均確定為陽性，另20份為RT-PCR和Panbio DENV IgM/IgG捕獲ELISA檢測陽性。依照WHO制定的標(biāo)準(zhǔn)，在血清學(xué)分類上17份血清標(biāo)本被確定為初次感染，13份血清為二次感染。我們所建立的DENV2 NS1抗原捕獲ELISA檢測30份以1：10稀釋血清標(biāo)本陽性的有25份，由此可見，我們的方法對DENV2病毒分

14、離和/或RT-PCR陽性的血清標(biāo)本檢測的總體陽性率為83．3%（25/30）。這結(jié)果與商品化的Panbio DENV NS1抗原捕獲ELISA對同樣為1：10稀釋的血清標(biāo)本的檢測結(jié)果一致，兩種方法的檢測陽性率均為83．3%（25/30），均有5份樣本檢測為陰性。兩種方法檢測初次感染急性期血清的陽性率均為88．2%（15/17），檢測二次感染的急性期血清的陽性率均為76．9%（10/13），采用統(tǒng)計(jì)學(xué)Fisher's exact test

15、分析顯示，兩種檢測方法對初次感染和二次感染的血清中NS1的檢出率相同且均無顯著性差異（P=0．628）。為了進(jìn)一步評價(jià)兩種NS1抗原捕獲ELISA的靈敏度，將NS1陽性血清進(jìn)行系列稀釋后檢測。從兩種方法檢測NS1均為陽性的25份血清標(biāo)本中選擇了19份血清量較多的標(biāo)本用于兩種方法檢測敏感性比較，結(jié)果顯示我們的方法敏感性明顯高于商品化的試劑盒，我們的方法甚至能檢測到稀釋了10000倍以后的血清標(biāo)本中的NS1抗原。 通過檢測DENV1

16、或其他的蟲媒病毒和非蟲媒病毒感染的一組血清標(biāo)本以進(jìn)一步評價(jià)我們所建立方法的特異性。我們分析了301份在先前的研究中用DENV1 NS1抗原捕獲ELISA檢測為陽性的DENV1感染患者急性期血清，以及132份其他的相關(guān)病毒感染的急性期血清，其中包括50例出血熱患者血清，13例乙型腦炎患者血清，49例麻疹患者血清和18例20份鉤端螺旋體感染患者血清，對以上標(biāo)本的檢測結(jié)果均為陰性，由此表明，我們所建立的方法具有登革病毒血清型特異性而且與其它相

17、關(guān)或無關(guān)病毒無交叉反應(yīng)，具有高度的特異性，可用于分型診斷和鑒別診斷。 綜合以上三個(gè)部分的研究結(jié)果，本研究的結(jié)論如下： 一、成功制備了一組具有血清型特異性的Ⅱ型登革病毒NS1單抗和四型登革病毒NS1交叉抗原結(jié)合位點(diǎn)單抗，為免疫診斷試劑研制、NS1蛋白功能的研究、登革病毒感染的發(fā)病機(jī)理研究等奠定基礎(chǔ)。 二、建立了基于單抗的NS1抗原捕獲ELISA，能靈敏的檢測到Ⅱ型登革病毒感染急性期血清中的NS1抗原，與進(jìn)口商品化的