腸道病毒71型基因組分析及登革病毒感染人單核細(xì)胞的研究.pdf

1、本文對腸道病毒71型基因組分析及登革病毒感染人單核細(xì)胞進(jìn)行了研究。本研究分為兩個部分：
　　第一部分：腸道病毒71型基因組分析。腸道病毒71型（Enterovirus71, EV71），為無包膜的正鏈RNA病毒，屬于小RNA病毒科（Picornaviridae）腸道病毒屬（Enterovirus）的成員。根據(jù)EV71-VP1基因序列的差異，將EV71分為3個亞型，其中B和C亞型還可進(jìn)一步劃分，該3個亞型分別為A，B1-B5和 C1

2、-C5。 EV71全基因序列長度為7400 nt左右，包括兩端的非編碼區(qū)，5’UTR（長度為750 nt左右）和3’UTR（長度為85 nt左右），中間為一個開放讀碼框（Open Reading Frame, ORF），分為三個區(qū)域：P1、P2和P3，翻譯一個有2193 aa的多聚蛋白，后者被水解成4個結(jié)構(gòu)蛋白VP1(297 aa)、VP2(254 aa)、VP3(242 aa)和VP4(69 aa)和7個非結(jié)構(gòu)蛋白2A(150 aa)

3、、2B(99 aa)、2C(329 aa)、3A(86 aa)、3B(22 aa)、3C(183 aa)和3D(462 aa)。 EV71是引起手足口?。℉and, foot, and mouth disease, HFMD）的主要病原體之一。EV71感染對象大多數(shù)為嬰幼兒和學(xué)齡前兒童，主要表現(xiàn)為手、足等部位皰疹。大多數(shù)情況下HFMD為自限性的疾病，但是，少數(shù)情況下，EV71可侵犯呼吸系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)而引起腦炎、心肌炎、肺

4、水腫和弛緩性麻痹等癥狀。近年來，EV71相關(guān)感染性疾病在溫州地區(qū)有上升的趨勢，給當(dāng)?shù)鼗純航】岛徒?jīng)濟(jì)發(fā)展發(fā)展帶來了較大的威脅。
　　目的：⑴掌握HFMD標(biāo)本的采集和分離方法，熟練病毒分離的實(shí)驗技巧。⑵通過細(xì)胞的培養(yǎng)方法觀察細(xì)胞在病毒感染過程中的病變情況。⑶通過對EV71序列的比對和分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，鑒定該6株EV71病毒的基因型別及分析其同其他EV71株之間的親緣關(guān)系。⑷EV71 C4亞型神經(jīng)毒力相關(guān)位點(diǎn)的分析。
　　方法

5、：①Vero細(xì)胞復(fù)蘇后鋪板，用無血清1640培養(yǎng)基研磨手足口病標(biāo)本。②用0.22?m過濾器將研磨后的液體過濾后加入處于對數(shù)生長期的Vero細(xì)胞中。③將細(xì)胞上清連續(xù)盲傳，并觀察細(xì)胞的病變情況，若細(xì)胞發(fā)生病變后，則收取上清。④提取上清中的病毒RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄PCR和PCR擴(kuò)增病毒序列。⑤利用EV71-VP1序列，對其進(jìn)行比對和分析，構(gòu)建VP1的系統(tǒng)進(jìn)化樹，從而確定該6株EV71的基因型別。⑥利用同型別的EV71株，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系樹，了解

6、該6株同其他株之間的進(jìn)化關(guān)系。⑦搜集來源于文獻(xiàn)報道和數(shù)據(jù)庫中的76株C4亞型EV71（41普通株和35毒力株）全基因序列。⑧82株（76株已報道的EV71株和本研究中的6株）UTR區(qū)核苷酸序列和ORF區(qū)氨基酸序列的比對。⑨找出普通組和毒力組同位點(diǎn)差異較大的核苷酸和氨基酸位點(diǎn)，利用SPSS進(jìn)行?2統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果：⑴成功獲得6株EV71全序列，鑒定為C4a型，序列長為7405 bp,5’UTR均為742 bp,3’ UTR均為

7、84 bp：6株 EV71包括2毒力株（11/EV71/Wenzhou/CHN/2014和109/EV71/Wenzhou/CHN/2014，序列號分別為：KT008670和KT008671）和4普通株（4/EV71/Wenzhou/CHN/2014、15/EV71/Wenzhou/CHN/2014、116/EV71/Wenzhou/CHN/2014、120/EV71/Wenzhou/CHN/2014，序列號分別為：KT008669、K

8、T345960、KT008672和KT345959）。序列比對分析得出，2毒力株的全基因序列相似度為98.57％，4普通株相似度為94.67%-96.07%。⑵系統(tǒng)進(jìn)化和親緣關(guān)系分析：4/EV71/Wenzhou/CHN/2014和15/EV71/Wenzhou/CHN/2014同分離自溫州本地的EV71/P1031/2013/China、EV71/P654/2013/China、 EV71/P123/2013/China、 EV71/

9、P40/2013/China及EV71/P16/2013/China親緣關(guān)系較近。然而，116/EV71/Wenzhou/CHN/2014和120/EV71/Wenzhou/CHN/2014同Hubei-WH/CHN/2012（序列號：KP198623，2012年分離自湖北）有較近的親緣關(guān)系。同時，2毒力株同本地株EV71/P156/2013/China（序列號：KP289421，于2013年分離自浙江溫州）親緣關(guān)系較近。⑶5’UTR序

10、列比對顯示出4個位點(diǎn)：GP151→TP151, AP328→CP328, GP422→AP422和 GP437→TP437在與普通株相比，2毒力株中同時出現(xiàn)變異。在 SLⅡ中，11/EV71/Wenzhou/CHN/2014中GP114→CP114以及2毒力株中GP151→TP151形成相應(yīng)的特殊二級結(jié)構(gòu)。在FCE和IRES的RNA二級結(jié)構(gòu)中，4個普通株毒力相同而2毒力株與它們不同且各異。⑷3’UTR的核苷酸序列顯示出98.8%-100

11、%的同源性，僅僅4個位點(diǎn)出現(xiàn)核苷酸序列的差異：2毒力株中出現(xiàn)TP10→CP10 or AP10的差異。根據(jù)比對發(fā)現(xiàn)，3’ UTR的二級結(jié)構(gòu)主要取決于7th和10th位核苷酸的差異，其分別對應(yīng)全序列中7328th和7331th。且4/EV71/Wenzhou/CHN/2014中的CP7和11/EV71/Wenzhou/CHN/2014中的TP10和“TP7或 CP10分別賦予了它們不同與其他的獨(dú)特RNA的二級結(jié)構(gòu)。⑸6株間的氨基酸序列比對

12、：其結(jié)構(gòu)蛋白中：VP4同源性為100%、VP2同源性為100%、 VP3同源性為99.17%-100%及VP1同源性為97.98%-100%；非結(jié)構(gòu)蛋白中：2A同源性為96.67%-100%、2B同源性為98.99%-100%、2C同源性為98.48%-100%、3A同源性為96.51%-100%、3B同源性為90.91%-100%、3C同源性為98.91%-99.45%以及3D同源性為97.48%-99.78%。此外，在2193個氨基

13、酸位點(diǎn)中，共46個位點(diǎn)出現(xiàn)變異情況。⑹在神經(jīng)毒性相關(guān)核苷酸和氨基酸位點(diǎn)的比對：一共使用了82株（45普通株和37毒力株），比對的結(jié)果表明：在5’UTR區(qū)共兩個核苷酸位點(diǎn)（TP488、CP577），在3UTR區(qū)共兩個核苷酸位點(diǎn)（CP10和 AP47）以及三個氨基酸位點(diǎn)（GlnP22 in VP1、AsnP57 in2A和IleP56 in3C)可能同EV71的神經(jīng)毒力有關(guān)。
　　結(jié)論：①本次溫州分離的6株EV71均為C4a，屬于中國

14、大陸主流行株。②通過比對5'UTR相關(guān)的重要元件的RNA二級結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，得知SLⅡ、FCE和IRES結(jié)構(gòu)在毒力株和普通株之間存在一些重要的差別，可能在某種程度上直接或者間接地影響著EV71 RNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的效率，從而可能間接地影響著EV71的神經(jīng)毒力。③6個新的未報道的位點(diǎn)可能同EV71的神經(jīng)毒力有關(guān)：5'UTR中的TP488和CP577、2A中的AsnP57、3C中的IleP56以及3'UTR中的CP10和 AP47。
　　

15、第二部分：登革病毒感染人單核細(xì)胞的研究。登革病毒（Dengue virus, DENV）是單股正鏈RNA病毒，為黃病毒屬家族成員?；蚪M全長11,000 nt。其含有一個開放閱讀框，編碼3個結(jié)構(gòu)蛋白（C, prM和 E）及7個非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b和 NS5）。登革病毒含有4個血清型，分別為DENV1-4，其主要通過白紋伊蚊和埃及伊蚊傳播。大部分感染者為自限性，但少數(shù)患者可引起登革熱

16、或登革出血熱（Dengue fever, DF or Severe/fatal dengue hemorrhagic fever, DHF）和登革休克綜合征（Dengue shock syndrome, DSS）。登革相關(guān)疾病在全世界100多個國家流行，包括非洲、美洲、中東、東南亞和西太平洋，2014年在我國廣東省大范圍流行。
　　目的：⑴了解不同型別的登革病毒感染人外周血單核細(xì)胞后，單核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的變化。⑵對D2V感染人外周血單

17、核細(xì)胞其IL-10分泌影響因素的探究。
　　方法：①等密度離心法結(jié)合磁珠分選技術(shù)分離人外周血單核細(xì)胞。②登革病毒感染人外周血單核細(xì)胞，對于6個感染組，分別命名為D1V-12h， D1V-24h，D2V-12h， D2V-24h，D3V-12h和D3V-24h，分別于0h、12h和24h收集細(xì)胞和上清。③利用細(xì)胞總RNA提取試劑盒，提取登革病毒感染后不同時間點(diǎn)的單核細(xì)胞總RNA。④逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，使用設(shè)計好的引物進(jìn)行實(shí)時熒光定量

18、PCR實(shí)驗，檢測相關(guān)基因在mRNA上的表達(dá)水平的變化。⑤將收集的上清用于ELISA實(shí)驗，檢測單核細(xì)胞在登革病毒刺激的作用下相關(guān)細(xì)胞因子的分析情況。⑥利用單克隆抗體Anti-TLR4阻斷單核細(xì)胞表面的TLR4后觀察細(xì)胞因子的分泌情況，在使用 MAPK通路中兩種抑制劑，即 P38-inhibitor JNK-MAPK-inhibitor后，通過檢測細(xì)胞因子的量，闡明這兩種蛋白的激活在 IL-10的分泌過程中的作用，通過上述三個位點(diǎn)的阻斷，并

19、結(jié)合分泌的細(xì)胞因子的量說明其關(guān)系。
　　結(jié)果：⑴Mapping的結(jié)果：每組的基因序列質(zhì)量測評得分均在20以上，并且一些短序列的測序結(jié)果準(zhǔn)確性更是超過99%，且每個時間點(diǎn)Mapped Rates無論在對照組和實(shí)驗組中均高于0.91，總體的Mapped Rates范圍在0.911-0.936之間；⑵維恩分析結(jié)果：在同對照組(沒有DENV感染)相比之下,176個基因在三個時間點(diǎn)都發(fā)生了改變,而相比之下,125個,134個和172個基因分

20、別在DV1、DV2和DV3組發(fā)生改變，109個基因在DV1、DV2和DV3組的12h保持不變，159基因改變在DV1、DV2和DV3組的24h保持不變。⑶Gene ontology(GO) and pathway分析：揭示了這些基因在生物過程（Biological processes，BP）、分子功能（Molecular functions，MF）和細(xì)胞成分（Cellular components，CC）在登革病毒感染單核細(xì)胞過程中的變

21、化。BP在12h顯示出補(bǔ)體激活，而24h的過量的表達(dá)則顯示登革病毒在激活免疫系統(tǒng)過程中的基因表達(dá)譜的變化。MF在12h和24h主要反應(yīng)抗原的結(jié)合以及細(xì)胞因子和趨化因子的活性。對于CC標(biāo)注顯示，12h主要定位于核糖體和核糖體亞基，而24h檢測的表達(dá)豐富的基因主要定位于細(xì)胞膜上和細(xì)胞外；⑷基因差異表達(dá)作用網(wǎng)絡(luò)：在一些特異的基因中存在許多不同的基因共表達(dá)模式。我們通過篩選發(fā)現(xiàn)了五個基因PGES、GM-CSF、IL-10、IL-19和 IL-2

22、0?？赡茉诘歉锊《靖腥救藛魏思?xì)胞早期，在免疫方面起著重要的調(diào)節(jié)和控制作用。IL2RA被 GM-CSF、IL-10、IL-19和 IL-20靶向激活，而PGES同其他基因之間的作用是相互的；⑸共調(diào)節(jié)表達(dá)的基因：在DENV感染人外周血單核血單核細(xì)胞中，GM-CSF、IL-10、IL-19、IL-20等細(xì)胞因子的表達(dá)水平在RT-qPCR實(shí)驗中上調(diào)，及在mRNA水平上隨著感染時間的持續(xù)，表達(dá)水平是上升的；⑹蛋白水平測定：在對不同感染時間點(diǎn)收集的

23、細(xì)胞上清中利用ELAIS技術(shù)檢測時，也同樣觀察到上述同mRNA上調(diào)趨勢相同的情況，即隨著感染那的時間的增加，單核細(xì)胞在登革病毒刺激后，早期會向細(xì)胞外分泌GM-CSF、IL-10、IL-19、IL-20等細(xì)胞因子，該4個基因同對照組相比在各個時間點(diǎn)均有上調(diào)的趨勢，同時該4個上調(diào)的細(xì)胞因子在RT-PCR和ELISA的實(shí)驗水平中得到了驗證；⑺IL-10的影響因素探究：在利用TLR4和MAPK激酶抑制劑后，對IL-10的分泌有一定的影響，TLR