PSGL-1 參與腸道病毒 71 型感染誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬.pdf

1、目的：
　　小兒手足口病（Hand-foot-mouth Disease，HFMD）是一種死亡率高、伴有兒童相關(guān)的無(wú)菌性腦膜炎和嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的季節(jié)性流行性感染性疾病，主要是腸道病毒71型（human enterovirus71，EV71）感染。因此，本實(shí)驗(yàn)從病毒受體與細(xì)胞自噬角度，利用細(xì)胞形態(tài)學(xué)、蛋白相互作用等研究方法，探究了P-選擇素糖蛋白配體-1（P-selectin glycoprotein ligand-1，PSG

2、L-1）在腸道病毒71型感染正常胃上皮細(xì)胞（normal gastric epithelial cell line-1，GES-1）誘導(dǎo)自噬調(diào)變中的作用，旨在為明確EV71致病機(jī)制提供重要的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為手足口病的早期預(yù)防和臨床治療提供新的思路。
　　方法：
　　1．細(xì)胞培養(yǎng)與病毒感染
　　分別培養(yǎng)人胃上皮細(xì)胞和橫紋肌肉瘤細(xì)胞（rhabdomyosarcoma，RD-A），將細(xì)胞培養(yǎng)在含10％胎牛血清（feta

3、l bovine serum，F(xiàn)BS）和1%青霉素/鏈霉素(200 U/ml)的L-谷氨酰胺DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，并置于含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱。待細(xì)胞增長(zhǎng)至90%，經(jīng)不含EDTA的胰蛋白酶消化進(jìn)行傳代培養(yǎng)。EV71（fuyang-0805）以一定的感染復(fù)數(shù)（indicated multiplicity of infection，MOI）感染GES-1。病毒感染3 h后清洗細(xì)胞，然后用含2%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，到感染的時(shí)

4、間點(diǎn)后收取培養(yǎng)細(xì)胞和上清液。收集感染細(xì)胞內(nèi)的病毒顆粒前，要3次反復(fù)凍融細(xì)胞。病毒原液存放在-80℃冰箱，感染之前4℃復(fù)蘇，病毒滴度可通過(guò)50%組織培養(yǎng)感染劑量（50%tissue culture infectious doses，TCID50）表示，根據(jù)Reed–Muench法使用96孔板接種RD-A細(xì)胞進(jìn)行不同病毒濃度梯度的感染來(lái)測(cè)定TCID50。
　　2．細(xì)胞處理
　　GES-1細(xì)胞以EV71滴度為MOI=10分別感染6

5、、12、24小時(shí)。封閉時(shí)，在感染前用含PSGL-1抗體(2 mg/ml)培養(yǎng)基培養(yǎng)GES-1，阻止EV71與細(xì)胞受體PSGL-1的結(jié)合。通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)自噬標(biāo)記蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein1 light chain3，LC3)時(shí)，將培養(yǎng)的GES-1轉(zhuǎn)染RFP-LC3/GFP-LC3質(zhì)粒24小時(shí)后進(jìn)行病毒感染，最后觀(guān)察并在同一倍鏡計(jì)數(shù)5個(gè)不同視野下細(xì)胞中熒光聚集點(diǎn)的數(shù)目和DAPI

6、染色的細(xì)胞核數(shù)，并計(jì)算LC3熒光斑點(diǎn)數(shù)/細(xì)胞數(shù)的百分率。
　　3．實(shí)時(shí)熒光定量PCR
　　用TRIzol Reagent分別從不同GES-1細(xì)胞處理組提取細(xì)胞的總RNA，并通過(guò)快速cDNA第一鏈cDNA合成試劑盒將RNA(2μg)轉(zhuǎn)換為cDNA。采用the Bestar? SybrGreen qPCR Mastermix通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)PSGL-1的RNA水平變化，設(shè)置熱循環(huán)條件：95℃初始變性2分鐘；95℃變

7、性10秒，退火溫度63℃30秒，最后延伸72℃30秒，共40次循環(huán)。
　　4．免疫熒光顯微鏡
　　在4℃用含4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液（PBS）固定細(xì)胞20分鐘后清洗；用含1%Triton X-100的PBS在室溫細(xì)胞穿孔15分鐘；用含5%牛血清白蛋白PBS液在室溫封閉60分鐘；用LC3與PSGL-1單克隆抗體在4℃孵育，過(guò)夜。次日，清洗后加入熒光標(biāo)記的二抗，并加入DAPI核染色；然后在熒光顯微鏡下觀(guān)察并采集圖像。
　

8、　5．免疫印跡和免疫共沉淀
　　收集細(xì)胞并裂解；測(cè)定蛋白質(zhì)濃度；樣品通過(guò)SDS-PAGE電泳分離，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜；膜用5%脫脂奶粉常溫封閉2小時(shí)，然后分別孵育P62抗體， LC3抗體，VP1抗體，PSGL-1和β-actin抗體4℃過(guò)夜；清洗后，用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗在室溫下孵育1小時(shí)。最后使用化學(xué)發(fā)光顯影劑顯影。免疫共沉淀：在4℃過(guò)夜孵育細(xì)胞裂解液與單克隆抗體(1 mg)后加入Protein G

9、 Agarose珠子，進(jìn)行2小時(shí)的搖動(dòng)孵育；洗滌珠子后溶解，取免疫共沉淀緩沖液通過(guò)12%的SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離（方法同免疫印跡）。
　　6．統(tǒng)計(jì)分析
　　采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，P<0.05判斷有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1. EV71感染誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞發(fā)生自噬：免疫印跡結(jié)果顯示隨著病毒感染時(shí)間的增加，LC3II逐漸增加，LC3-I向LC3II轉(zhuǎn)換明顯；且在12 h后呈明顯增加(P<0.05)，

10、同時(shí)免疫熒光結(jié)果顯示病毒感染12 h后LC3點(diǎn)狀聚集明顯增加(P<0.01)。
　　2. PSGL-1抗體封閉受體可阻止EV71感染GES-1：GES-1細(xì)胞在PSGL-1抗體預(yù)先封閉后再染毒，與未封閉組相比胞內(nèi)病毒蛋白結(jié)構(gòu)蛋白VP-1明顯減少(P<0.001)，同時(shí)檢測(cè)胞內(nèi)病毒滴度也顯著降低(P<0.01)。
　　3. EV71感染GES-1促進(jìn)PSGL-1高表達(dá)和點(diǎn)狀聚集：通過(guò)免疫印跡檢測(cè)顯示感染組PSGL-1明顯增多(

11、P<0.05)，同時(shí)實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)得感染組PSGL-1的mRNA水平明顯升高(P<0.05)；免疫熒光結(jié)果顯示感染組PSGL-1出現(xiàn)明顯點(diǎn)狀聚集(P<0.01)。
　　4. PSGL-1參與EV71感染GES-1誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬：采用免疫熒光技術(shù)觀(guān)察發(fā)現(xiàn)PSGL-1可與LC3在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生共定位，通過(guò)免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)PSGL-1和P62有蛋白相互作用。
　　結(jié)論：
　　EV71感染GES-1誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，而這一現(xiàn)象