靶向5’UTR的化學(xué)修飾siRNAs抑制腸道病毒71型感染的研究.pdf

1、背景與目的:
　　腸道病毒71型(EV71)是引起手足口病的主要病原體,多感染學(xué)齡前兒童,尤以3歲以下發(fā)病率最高。近年來,EV71的暴發(fā)和流行在亞太地區(qū)呈明顯上升趨勢,且引起嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。在世界大多數(shù)國家和地區(qū)基本消滅脊髓灰質(zhì)炎病毒之后,EV71被認為是臨床最重要的嗜神經(jīng)性病毒,嚴重危害兒童的身體健康。目前臨床治療EV71感染主要是減輕癥狀,尋求安全、特異、有效的藥物治療手段已經(jīng)成為世界范圍關(guān)注的熱點。
　　RNA

2、干擾(RNAi)是雙鏈 RNA介導(dǎo)的序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默。由于RNAi具有特異性、高效性等特點,它已被成功應(yīng)用于抗病毒感染研究。分子流行病學(xué)分析表明,EV71中國流行株在近10余年內(nèi)沒有發(fā)生很大的基因多態(tài)性改變,所以尋求 RNAi的有效靶點、通過效應(yīng)分子小干擾RNA(siRNA)抑制多株EV71中國流行株成為可能。既往研究表明,靶向EV71基因組3’UTR、VP1、3D、2C、3C區(qū)域的siRNAs能夠有效抑制EV71感染,而針對

3、EV71基因組高度保守的5’非編碼區(qū)(UTR)的特異、有效siRNAs尚未見到報道。EV71基因組5’UTR高度保守,其在病毒 RNA的合成以及病毒蛋白的翻譯過程中發(fā)揮重要作用,以此為靶點篩選有效siRNAs將可能具有廣譜抗EV71效能。近年來,siRNAs的化學(xué)修飾研究取得了很大的進步,對篩選的有效siRNAs進行合適的化學(xué)修飾可以優(yōu)化siRNA的特性,極大推動siRNA進入臨床的可能性。
　　本研究旨在篩選靶向EV71基因組高

4、度保守的5’UTR的有效siRNAs,確定有效靶點序列,并通過化學(xué)修飾優(yōu)化siRNAs的特性,檢測它們針對EV71中國流行株是否具有廣譜抗病毒效能,并研究靶向5’UTR的化學(xué)修飾siRNAs對乳鼠EV71感染的抑制作用,為RNAi治療EV71走向臨床提供一定的實驗基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.采用多特征融合的方法,設(shè)計靶向EV71基因組5’UTR的siRNAs。
　　2.通過細胞毒性實驗檢測siRNAs對RD細胞生存和生

5、長的影響。
　　3.通過細胞生存實驗、實時TaqMan RT-PCR實驗篩選有效的siRNAs,確定有效靶點序列。
　　4.針對篩選出的兩個有效siRNAs的雙鏈RNA的UC序列分別進行2’-OMe修飾及2’-F修飾,得到6個未修飾及化學(xué)修飾siRNAs(si-1、si-1OMe、si-1F、si-2、si-2OMe、si-2F)。
　　5.通過激光共聚焦及流式細胞儀技術(shù)檢測siRNA轉(zhuǎn)染情況。
　　6.從細胞毒

6、性、RNAi活性、免疫刺激反應(yīng)、血清穩(wěn)定性四個方面,對靶向5’UTR的未修飾siRNAs與相應(yīng)的化學(xué)修飾siRNAs進行比較。
　　7.將Genbank中近5年來發(fā)布的具有全基因序列的108株EV71中國流行株進行比對,分析siRNAs對應(yīng)序列的同源性。
　　8.針對核苷酸序列分析結(jié)果,采用另一株中國流行株EU703812進行實驗(此病毒株基因組特點是在115-133核苷酸序列與si-1對應(yīng)序列完全匹配,而在648-666核

7、苷酸序列與si-2對應(yīng)序列有一個核苷酸錯配,此相同且單一核苷酸錯配在近5年來發(fā)布的具有全基因序列的108株中國流行株中達41.66％),比較siRNAs對兩株不同EV71中國流行株感染的抑制作用。
　　9.將si-2改變一個核苷酸使之完全與病毒株EU703812對應(yīng),并進行修飾,評估未修飾及化學(xué)修飾siRNAs對病毒株EU703812的抑制作用。
　　10.通過EV71感染乳鼠的實驗研究,建立EV71感染乳鼠模型。
　

8、　11.通過乳鼠癥狀、體重、生存率等指標評價化學(xué)修飾siRNAs對乳鼠的毒性。
　　12.通過觀察感染乳鼠的癥狀、體重、生存率,實時熒光定量 RT-PCR檢測感染乳鼠小腸組織中EV71 RNA轉(zhuǎn)錄水平,組織切片HE染色觀察感染乳鼠小腸組織病變及免疫組化檢測感染乳鼠腸上皮細胞中EV71特異性VP1蛋白表達,初步探討靶向5’UTR的化學(xué)修飾siRNAs對乳鼠EV71感染的抑制作用。
　　結(jié)果:
　　1.篩選出靶向EV71基

9、因組高度保守的5’UTR的有效siRNAs
　　(1)初步篩選出滿足設(shè)計條件的靶向EV71基因組5’UTR的si-1、si-2、si-3、si-4、si-55個siRNAs。
　　(2)所篩選出的siRNAs均未影響RD細胞生存及生長,對培養(yǎng)細胞無明顯毒性。
　　(3)靶向EV71基因組5’UTR的si-1、si-2能夠明顯提高感染細胞的生存率、降低感染細胞中EV71 RNA的轉(zhuǎn)錄水平,且這種抗病毒效能具有序列特異性。

10、
　　2.靶向5’UTR的未修飾及化學(xué)修飾siRNAs對EV71感染的體外抑制作用
　　(1)SiRNA轉(zhuǎn)染6 h后,激光共聚焦顯微鏡檢測發(fā)現(xiàn)帶有熒光素標記的si-2FAM在RD細胞漿中清晰可見,隨著si-2FAM濃度的升高,RD細胞中si-2FAM含量明顯增加;進一步用流式細胞儀精確檢測轉(zhuǎn)染效率,在25 nM、50 nM、100 nM的濃度下,si-2FAM的轉(zhuǎn)染效率分別為79.47±1.79%、87.73±2.67%、9

11、7.17±0.86%。因此,50 nM、100 nM已足夠進行下一步RNAi實驗。
　　(2)無論是未修飾的還是化學(xué)修飾的21 nt siRNAs均未影響RD細胞生存及生長,對培養(yǎng)細胞無明顯毒性。
　　(3)與相應(yīng)的未修飾siRNAs相比,化學(xué)修飾的si-1F、si-2OMe、si-2F顯現(xiàn)出相似的的RNAi的活性,能夠延緩及減輕EV71感染致CPE、明顯提高EV71感染細胞的生存率、明顯降低感染細胞中 EV71 RNA的轉(zhuǎn)

12、錄水平、明顯降低感染細胞中EV71特異性VP1蛋白的表達、明顯降低EV71病毒滴度;靶向EV71基因組5’UTR
　　648-666核苷酸序列的化學(xué)修飾的si-2OMe、si-2F抗病毒效能優(yōu)于靶向EV71基因組5’UTR115-133核苷酸序列的si-1F;化學(xué)修飾的si-1OMe抗病毒效能明顯降低。
　　(4)轉(zhuǎn)染未修飾及化學(xué)修飾 siRNAs的細胞中均未出現(xiàn) PKR的升高,siRNAs作用的機制是由于特異性RNAi而非

13、PKR的活化及干擾素反應(yīng)。
　　(5)未修飾的si-2在10%FBS、100%鼠血清及100%人血清中孵育6 h后均不能檢測出,而化學(xué)修飾的si-2OMe、si-2F在同樣的條件下至少能檢測到48 h。
　　3. SiRNAs對EV71中國流行株感染的抑制效能
　　(1)通過核苷酸序列分析表明,靶向EV71基因組5’UTR115-133核苷酸序列的siRNAs對應(yīng)序列的同源性達71.30%,靶向EV71基因組5’UTR

14、648-666核苷酸序列的siRNAs對應(yīng)序列的完全同源性達37.04%,相同且單一核苷酸不同的達41.66%。
　　(2)SiRNAs對兩株EV71中國流行株感染的抑制作用比較表明:si-1、si-2均可提高感染兩株病毒的RD細胞生存率、降低細胞中 EV71 RNA的轉(zhuǎn)錄水平;si-1對兩株病毒株同樣有效,si-2對EU703812病毒株的效能低于HM003207病毒株,但仍能明顯提高感染EU703812病毒株的RD細胞生存率、

15、降低細胞中EV71 RNA的轉(zhuǎn)錄水平。
　　(3)改變一個核苷酸的siRNAs對病毒株EU703812的抑制作用研究表明,未修飾及化學(xué)修飾siRNAs均可以顯著提高感染EU703812病毒株的RD細胞生存率、降低細胞中EV71 RNA的轉(zhuǎn)錄水平、減少細胞中EV71特異性VP1蛋白的表達。
　　4.靶向5'UTR的化學(xué)修飾siRNAs對乳鼠EV71感染的抑制作用
　　(1)建立了EV71感染1日齡ICR乳鼠模型。感染EV

16、71的乳鼠可出現(xiàn)精神不振、活動減少等癥狀,在感染6~7天后上述癥狀消失。死亡時間多發(fā)生在病毒感染后24~96 h,死亡率為30.0%。感染乳鼠體重增長相對緩慢,6~7天時與正常乳鼠差異最大,之后存活的感染乳鼠與正常乳鼠體重差距縮小。EV71感染第3天、5天,乳鼠小腸、肺、骨骼肌均可檢測出病毒RNA,7天骨骼肌不能檢測出病毒RNA,小腸、肺組織中含量也比較低,第14天各種組織均不能檢測出病毒 RNA。感染第5天乳鼠小腸組織病變明顯,腸上皮

17、細胞出現(xiàn)空泡變性。
　　(2)化學(xué)修飾 siRNAs對乳鼠毒性研究表明,直至14天,轉(zhuǎn)染 si-2A-OMe或si-2A-F的乳鼠精神、活動均無明顯變化,未出現(xiàn)死亡,體重增長未發(fā)生變化。
　　(3)通過RNAi乳鼠體內(nèi)實驗研究表明,靶向5’UTR的化學(xué)修飾siRNAs改善了乳鼠的感染癥狀,提高了EV71感染乳鼠的生存率,明顯降低了感染乳鼠小腸組織中EV71 RNA的轉(zhuǎn)錄水平,減輕了小腸組織病變,降低了腸上皮細胞中EV71特異

18、性VP1蛋白表達。
　　結(jié)論:
　　本研究篩選出靶向EV71基因組高度保守的5’UTR的兩個有效siRNAs,確定了EV71基因組5’UTR115-133核苷酸序列與648-666核苷酸序列兩個新的有效靶點。首次研究化學(xué)修飾siRNAs對EV71感染的抑制作用,獲得生物利用度高、穩(wěn)定性強的有效化學(xué)修飾siRNAs。通過核苷酸序列分析及不同的EV71中國流行株驗證,發(fā)現(xiàn)靶向EV71基因組5’UTR115-133核苷酸序列與64

19、8-666核苷酸序列的有效siRNAs可能對多株EV71中國流行株具有廣譜抗病毒效能。針對EV71基因組5’UTR648-666靶點的siRNAs具有更高的抗病毒效能?？舍槍V71基因組5’UTR115-133、648-666靶點序列設(shè)計siRNAs混合物(包括考慮單一核苷酸的錯配在同一位點設(shè)計一對siRNAs),對多株EV71中國流行株可能具有更廣譜的抗病毒效能。此外,通過乳鼠體內(nèi)試驗進一步證實化學(xué)修飾的si-2A-OMe、si-2