腸道病毒71型致神經系統(tǒng)感染的影響因素初步分析.pdf

1、目的：
　　本文主要從廣東省2008年～2010年EV71的流行病學分析、VIM在EV71感染HBMEC中的作用兩方面來探究EV71所致神經系統(tǒng)的影響因素，以確定EV71病毒VP1蛋白的A289T變異，以及VIM受體與EV71神經系統(tǒng)感染的關系;并明確EV71病毒感染血腦屏障細胞是神經系統(tǒng)感染的一條重要途徑。本研究不但有助于分析EV71的流行病特征、病毒變異情況;也將為EV71病毒的神經系統(tǒng)感染建立有意義的預警信號，及早發(fā)現(xiàn)易感人

2、群，及時采取有效的防范措施，對于減少神經系統(tǒng)感染的發(fā)病率具有重要的意義。
　　方法：
　　1.廣東省2008～2010年EV71的流行病學分析
　　收集2008～2010年廣東省多個市區(qū)送至廣東省疾病預防控制中心檢驗的樣本（包括糞便、咽拭子、腦脊液等），采用熒光定量PCR技術和病毒分離培養(yǎng)技術確診為EV71感染的共194例樣本。根據(jù)癥狀的差異分成EV71神經系統(tǒng)感染組和非神經系統(tǒng)感染兩組。分別提取病人的RNA，逆轉錄合

3、成cDNA，并擴增全長的病毒VP1序列。通過比對病毒VP1序列和構建系統(tǒng)進化樹確定病毒的分型;采用Logistic回歸分析影響患者致神經系統(tǒng)感染的因素;病毒的VP1基因序列用DNAman軟件翻譯成蛋白質序列，定義在同一個位點上，出現(xiàn)兩種以上氨基酸為一個變異。
　　2.人腦微血管內皮細胞VIM敲除細胞系的建立
　　在美國國立生物技術信息中心(NCBI)的數(shù)據(jù)庫中找到VIM的基因序列，找到VIM基因CDS區(qū)，分析其基因結構，明確

4、CDS的外顯子部分。按照基因本身的性質，選擇候選的待敲除位點后設計并合成識別靶位點的一對DNAOligos。把sgRNA連接到Lenti CRISPRv2載體中并構建Cas9質粒。將構建好的目的質粒及空白對照分別包裝成慢病毒再感染HBMEC，篩選出穩(wěn)定表達VIM-KO的細胞株以及正常對照株。
　　3.VIM在EV71感染HBMEC中的作用分析
　　在RD細胞中擴增并滴定的病毒分別感染正常和VIM-KO的HBMEC，觀察HBM

5、EC的病變效應。采用熒光定量PCR技術檢測EV71病毒在正常和VIM-KO的細胞中吸附能力、復制能力和病毒核酸釋放水平的差異。同時檢測在HBMEC正常和VIM-KO細胞中病毒VP1蛋白合成的差異。
　　結果：
　　1.廣東省2008～2010年EV71的主要型別為C4a型
　　在2008～2010年期間，廣東省各個地區(qū)流行的EV71病毒株為C4a型，也是目前我國主要的流行株。同時發(fā)現(xiàn)此型在廣東省流行過程中已經開始演化，

6、增加了三個族，即C4a2～C4a4族。
　　2.EV71病毒株型別的時間、地區(qū)分布
　　從各病毒株的分布時間來看:2008年四種均有，但主要集中在C4a1型;2009年的流行株為C4a1和C4a2型;而在2010年，除湛江的一株屬于C4a4型，其余均為C4a1型。從地區(qū)分布來看:大部分地區(qū)的病毒株型別為C4a1和C4a2型;只有2008年東莞分株009-08-M單獨構成了C4a3型;C4a4也僅分別出現(xiàn)在佛山和湛江。綜合來看

7、各病毒株的流行并沒有地區(qū)和時間集中趨勢。
　　3.病毒A289T變異與神經系統(tǒng)感染有關
　　隨著年齡的增加，神經系統(tǒng)感染患者的發(fā)病率明顯下降(P＜0.05)。對患者進一步用Logistic回歸法分析其性別、年齡、病毒型別、VP1變異對患者臨床癥狀輕重有無神經系統(tǒng)癥狀的影響。結果表明EV71患者的臨床癥狀與性別、病毒的型別與有無神經系統(tǒng)癥狀沒有無統(tǒng)計學相關性;年齡和病毒A289T變異與患者的臨床表現(xiàn)相關，病毒289A(289丙

8、氨酸)容易致EV71神經系統(tǒng)感染(P＜0.05，OR=2.360,95％ CI為1.163-4.659)。
　　4.人腦微血管內皮細胞VIM敲除細胞系的成功建立
　　采用CRISPR-Cas9技術及慢病毒載體包裝系統(tǒng)包裝出VIM-KO和正常對照的病毒后，感染HBMEC48 h后觀察到GFP的表達接近70％～80％。用嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定的HBMEC VIM-KO和對照細胞株后，用VIM的特異性抗體分別檢測HBMEC對照和VIM

9、-KO中的VIM表達量。結果發(fā)現(xiàn)VIM-KO的細胞中VIM的表達量下降了90％以上，說明此次VIM敲除效果較好。
　　5.VIM在EV71感染HBMEC中的作用分析
　　EV71進入細胞后，由于其對細胞的損傷，會導致細胞的形態(tài)發(fā)生改變。分別用病毒感染對照以及VIM-KO的HBMEC，發(fā)現(xiàn)病毒感染HBMEC正常對照細胞24 h后，細胞出現(xiàn)了皺縮，變圓甚至破碎;隨著感染時間的延長，到了48h后，部分細胞已經脫落而飄浮在培養(yǎng)中。相

10、比之下，EV71同樣的MOI感染VIM-KO，24 h后細胞的形態(tài)幾乎不變，即使到了48 h，細胞的形態(tài)改變很小，只有很小一部分細胞開始變圓。說明EV71感染能引起HBMEC病變效應，但在VIM敲除的細胞中，細胞狀態(tài)變化不大，病變效應很弱。EV71侵襲細胞的第一步是吸附于細胞表面。用熒光定量PCR檢測HBMEC對照和VIM-KO表面的病毒核酸量的差異，結果表明與對照相比，VIM敲除后EV71在細胞表面的吸附下降了40％。EV71感染細胞

11、24 h和48h后，正常的HBMEC中病毒量分別同比增加到3倍和8倍，而VIM-KO細胞復制的非常少，24 h后僅為0h的1.3倍，48h后病毒量也僅為0h的2倍左右。EV71感染HBMEC48 h后，VIM敲除細胞EV71病毒核酸量是對照細胞的1/12。細胞培養(yǎng)液上清EV71病毒核酸量檢測結果表明，VIM敲除的細胞比對照細胞少1.4倍。EV71病毒在細胞內的核酸復制和合成蛋白是基本同步的，通過檢測EV71在HBMEC對照和敲除的細胞內

12、合成蛋白的差異，發(fā)現(xiàn)VIM敲除后病毒VP1蛋白的合成也比HBMEC對照細胞少很多。
　　結論：
　　1、在2008～2010年期間，廣東省各個地區(qū)流行的EV71病毒株為C4a型，也是目前我國主要的流行株。同時發(fā)現(xiàn)此型在廣東省流行過程中已經開始演化，增加了三個族，即C4a2～C4a4族。EV71病毒亞型在時間、地區(qū)上的分布無明顯趨勢。
　　2、病毒的A289T變異與與EV71神經系統(tǒng)感染有關，病毒289A（289丙氨酸）

13、容易致EV71神經系統(tǒng)感染。本次所獲得的A289T變異位點是廣東省194例EV71感染人群的分子流行病學的研究結果，此位點的進一步研究，對于廣東省乃至全國的EV71感染的防治具有實際的指導意義。
　　3、VIM是HBMEC表面EV71的受體，EV71通過與受體VIM的結合而侵襲HBMEC，并且進一步影響EV71在細胞中的復制甚至釋放。本課題提出EV71感染神經系統(tǒng)的通路假說:EV71通過VIM受體介導的RNA釋放，進入HBMEC細