雞病毒性呼吸道病原多重RT-PCR檢測方法的建立.pdf

1、雞的呼吸道感染在養(yǎng)雞生產(chǎn)實踐中是一類極為常見的疾病。感染病原包括病毒、細(xì)菌、霉形體以及其它致病因素。大多數(shù)情況下是幾種病原的混合感染或不同病原先后繼發(fā)感染，致使雛雞生長發(fā)育遲緩、成年雞產(chǎn)蛋下降，可引起各種日齡雞只的死亡。雞新城疫(Newcastle disease，ND)、雞傳染性支氣管炎(Infectious laryngotrache，IB)以及禽流感(Avian influenza，AI)的H5、H9亞型是一類在臨床上有相似呼吸道

2、癥狀的病毒性傳染病，均屬于RNA病毒，僅根據(jù)臨床癥狀和病理表現(xiàn)很難準(zhǔn)確及時作出診斷。不同的病毒感染其后續(xù)的處置方案亦不相同，延誤診斷時間或誤診均能給養(yǎng)雞企業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。因此，本實驗擬建立ND-IB-AIH5-AIH94種禽類呼吸道病原的多重RT-PCR鑒別診斷方法，并對其特異性和敏感性進(jìn)行檢測，為臨床上提供特異性強、敏感性高且省時省力的實驗室鑒別診斷方法，其主要試驗結(jié)果如下：
　　 1.4種禽類呼吸道病原擴增引物的設(shè)計和擴

3、增方法的建立
　　 根據(jù)NDV的F基因片段，IBV的N基因片段以及AIV的H5、H9亞型的HA基因片段設(shè)計引物，對四對引物分別進(jìn)行梯度RT-PCR擴增，在此基礎(chǔ)上選擇合適的RT-PCR的退火溫度同時對四對引物分別進(jìn)行引物濃度的優(yōu)化，確定普通RT-PCR的退火溫度為58℃，，引物濃度為別為0.32pmol/μL(NDV)、0.32 pmol/μL(IBV)、0.24pmol/μL(H5)、0.24pmol/μL(H9)。最后設(shè)計的

4、四對引物、優(yōu)化的退火溫度和引物濃度能夠通過普通RT-PCR技術(shù)特異性擴增NDV、IBV、AIV的H5、H9亞型的基因片段，所擴增片段長度分別為：520bp(NDV)、748bp(IBV)、151bp(H5)、266bp(H9)。
　　 2.4種禽類呼吸道病原多重RT-PCR條件的優(yōu)化
　　 在普通RT-PCR的基礎(chǔ)上對多重RT-PCR進(jìn)行優(yōu)化，分別從引物濃度比、Taq酶濃度、Mg2+濃度、dNTP濃度、退火溫度這五個方面

5、進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化的結(jié)果為Mg2+濃度為3.0mM，dNTP濃度為0.09U/μl，退火溫度為58℃，引物濃度分別為0.32pmol/μL(NDV)、0.32 pmol/μL(IBV)、0.24pmol/μL(H5)、0.24pmol/μL(H9)，優(yōu)化后的結(jié)果能夠很好的鑒別診斷這四種病毒以及這四種病毒的混合感染。
　　 3.4種禽類呼吸道病原多重RT-PCR方法的建立和初步應(yīng)用
　　 建立的每種引物均能從陽性材料中擴增出相