GeXP多重RT-PCR技術(shù)在病毒性腦炎病原檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、目的：利用GeXP多重基因表達(dá)遺傳分析系統(tǒng)，建立一種能夠同時(shí)檢測(cè)腦炎相關(guān)的8種蟲媒病毒的多重逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(mRT-PCR)方法，并對(duì)此方法作出初步評(píng)價(jià)。
　　 方法：以腦炎相關(guān)的8種蟲媒病毒為研究對(duì)象，包括版納病毒(Bannavirus，BAV)，乙型腦炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)，蜱傳腦炎病毒(Tick-borneencephalitisvirus，TBEV)，Tahyna病毒(

2、Tahynavirus，TAHV)，遼寧病毒(Liaoningvirus，LNV)，科薩努爾森林病病毒(Kyasanurforestdiseasevirus，KFDV)，辛德畢斯病毒(Sindbisvirus，SINV)及云南環(huán)狀病毒(Yunnanorbivirus，YUOV)并加入小鼠腦脊髓炎病毒(Theiler'sMouseEncephalomyelitisvirus，TMEV)做為內(nèi)部對(duì)照。利用GeXP系統(tǒng)建立多重RT-PCR檢測(cè)

3、方法，設(shè)計(jì)各病毒特異引物并進(jìn)行篩選，以病毒分離培養(yǎng)物和陽性標(biāo)本來驗(yàn)證引物及多重反應(yīng)體系的特異性，根據(jù)PCR結(jié)果來優(yōu)化多重反應(yīng)體系及反應(yīng)條件，構(gòu)建單克隆質(zhì)粒并進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄并制備標(biāo)準(zhǔn)品即體外轉(zhuǎn)錄RNA的梯度稀釋液來檢測(cè)多重體系的靈敏度。用該方法對(duì)未知標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，并將檢測(cè)結(jié)果與其它方法進(jìn)行比較，根據(jù)比較的結(jié)果對(duì)該方法做出評(píng)價(jià)。
　　 結(jié)果：篩選后的各病毒引物擴(kuò)增片段大小與設(shè)計(jì)相符且特異性強(qiáng)，相互之間無交叉反應(yīng)。優(yōu)化后的多重檢測(cè)體系，

4、可擴(kuò)增出各病毒對(duì)應(yīng)的特異片段，可在102拷貝/μL水平同時(shí)并特異地檢測(cè)出8種（共13個(gè)特異片段）腦炎相關(guān)蟲媒病毒RNA。通過對(duì)37份蚊蟲碾磨液提取核酸的標(biāo)本檢測(cè)，可看出GeXP多重檢測(cè)方法特異性強(qiáng)，且靈敏度明顯高于病毒分離及半巢式PCR。
　　 結(jié)論：成功建立了一種基于GeXP的多重RT-PCR技術(shù)平臺(tái)的8種腦炎相關(guān)蟲媒病毒的檢測(cè)新方法，該方法具有高通量、靈敏度高、特異性強(qiáng)且快速等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)病毒性腦炎的分子診斷及流行病學(xué)調(diào)查具有重