重慶辣椒病毒病的病原鑒定及多重RT-PCR檢測體系的構(gòu)建.pdf

1、重慶是我國辣椒的主產(chǎn)區(qū)和集中消費區(qū)之一，近年來辣椒病毒病危害嚴重，嚴重影響產(chǎn)量和品質(zhì)。為了弄清辣椒病毒病的主要毒原，本研究分別于2013年和2014年從重慶北碚、彭水、武隆、萬州、石柱、巫山、巫溪、永川、九龍坡、涪陵、秀山及合川等12個區(qū)縣采集了278份辣椒病毒病樣品。利用煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)、蕪菁花葉病毒（Turnip mo

2、saic virus，TuMV）、蠶豆萎蔫病毒2號(Broad bean wiltvirus2，BBWV-2)、番茄花葉病（Tomato mosaic virus，ToMV）及番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）的特異性血清，采用斑點免疫雜交法(Dot-ELISA)進行檢測。結(jié)果顯示，從病毒總檢出率來看，CMV的總檢出率最高，達56.47％; TMV其次，為33.45％; TSWV的總檢出率最低，

3、僅為14.39％。辣椒上病毒病復(fù)合侵染現(xiàn)象普遍且類型多樣，最主要的復(fù)合侵染類型包括TMV+CMV、TMV+TuMV及TMV+CMV+TuMV，其中TMV+CMV的總檢出率最高，為14.38％。從各地區(qū)辣椒發(fā)病情況來看，石柱地區(qū)受病毒病侵染最嚴重，6種病毒的總檢出率均超過30.00％。
　　根據(jù)Genbank中已登錄的序列設(shè)計特異性引物，本研究建立了辣椒輕斑駁病毒(Pepper mild mottle virus，PMMoV)、辣椒

4、葉脈斑駁病毒(Chilli vein mottle virus，ChiVMV)、馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)、TSWV及TuMV的RT-PCR檢測體系。擴增得到了重慶辣椒上PMMoV、PVY及TSWV的CP基因序列和ChiVMV、TuMV的部分CP基因序列。序列測定及分析表明:PMMoV重慶分離物PMMoV-WL02與中國的2個分離物PMMoV-BD和Guizhou的相似性最高，為99.2％;ChiVMV重慶分離

5、物ChiVMV-WZ07與中國莧色藜上分離物Pp3相似性最高，達99.8％％; PVY重慶分離物PVY-BB31與中國河北馬鈴薯上分離物HeB20相似性最高，為98.5％，屬于PVY普通株系(PVYO); TSWV重慶分離物TSWV-SZ21與中國2個分離物CG-1和KM-T相似性最高，為99.6％，這4種病毒的系統(tǒng)進化均表現(xiàn)出一定的地理相關(guān)性。TuMV重慶分離物TuMV-WZ08與中國油菜上的分離物Baoji2和Xianyang3的相

6、似性最高，達99.5％。
　　通過血清學(xué)和分子檢測發(fā)現(xiàn)重慶地區(qū)辣椒普遍受TMV、CMV、TuMV、BBWV-2及PMMoV的侵染，且辣椒上病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象復(fù)雜多樣。本研究建立了同時檢測TMV、CMV、TuMV、BBWV-2及PMMoV等5種主要辣椒病毒的多重RT-PCR體系，并對該檢測體系的擴增條件和參數(shù)進行了優(yōu)化。將單一RT-PCR檢測結(jié)果與多重RT-PCR結(jié)果進行比對，證實了該體系檢測結(jié)果的準確性，同時提高了檢測效率，降低了檢