丹參多酚酸鹽對(duì)陽(yáng)離子化牛血清白蛋白致膜性腎病大鼠的腎保護(hù)作用及對(duì)腎組織CD2AP、Desmin蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、目的：膜性腎病是引起成人腎病綜合征的最常見(jiàn)病因，近年來(lái)臨床發(fā)現(xiàn)膜性腎病患病率有明顯上升趨勢(shì)，其病因尚有待進(jìn)一步研究。膜性腎病是自身免疫導(dǎo)致的以腎小球上皮細(xì)胞下免疫復(fù)合物彌漫性沉積，腎小球基底膜增厚伴“釘突”形成為病理特征的一種常見(jiàn)腎炎類型，臨床上大多數(shù)患者表現(xiàn)為腎病綜合征或無(wú)癥狀性蛋白尿。膜性腎病患者血液常處于高凝狀態(tài)，是導(dǎo)致疾病進(jìn)展的重要因素。丹參多酚酸鹽具有降低血液黏稠度，改善膜性腎病患者的血液高凝狀態(tài)，改善腎臟微循環(huán)以改善腎功能、

2、延緩慢性腎臟疾病進(jìn)展的作用。本研究通過(guò)尾靜脈注射陽(yáng)離子化牛血清白蛋白(C-BSA)的方法建立膜性腎病大鼠模型，并應(yīng)用丹參多酚酸鹽低、中、高劑量進(jìn)行干預(yù)治療，以鹽酸貝那普利作為對(duì)照組，通過(guò)觀察大鼠的24小時(shí)尿蛋白定量（24hUPQ）、血清總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）等生化指標(biāo)以及腎組織CD2相關(guān)蛋白(CD2AP)、結(jié)蛋白(Desmin)的表達(dá)，來(lái)探討丹參多酚酸

3、鹽對(duì)陽(yáng)離子化牛血清白蛋白致膜性腎病大鼠的治療作用及機(jī)制，從而為臨床應(yīng)用丹參多酚酸鹽治療膜性腎病提供理論依據(jù)。
　　方法：選用清潔級(jí)健康雄性SD大鼠62只，重180±20g，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后測(cè)尿蛋白均為陰性，測(cè)24小時(shí)尿蛋白定量均小于5mg。隨機(jī)將其分為正常組10只、造模組52只，給正常組編號(hào)。從第二周開(kāi)始造模組大鼠雙前肢腋下及雙腹股溝皮下注射弗氏不完全佐劑乳化的C-BSA，隔日一次，預(yù)免疫1周；正常組大鼠相同樣部位皮下注射

4、等體積弗氏不完全佐劑乳化的生理鹽水，隔日一次，連續(xù)1周。第三周開(kāi)始正式免疫，造模組大鼠尾靜脈注射 C-BSA，隔日一次，連續(xù)免疫4周；正常組大鼠尾靜脈注射等量的生理鹽水，隔日一次，連續(xù)4周。免疫結(jié)束后用尿蛋白試紙條測(cè)造模組大鼠尿蛋白均為陽(yáng)性，并隨機(jī)抽取2只造模大鼠，進(jìn)行腎組織免疫熒光、光鏡、電鏡檢查，觀察到免疫復(fù)合物沉積伴基底膜彌漫性增厚，證實(shí)膜性腎病造模成功。再按照完全隨機(jī)法將剩余的造模大鼠隨機(jī)分為5組，即模型組、鹽酸貝那普利組、丹參

5、多酚酸鹽低、中、高劑量組，并編號(hào)。編號(hào)之后代謝籠內(nèi)留取所有大鼠24小時(shí)尿液，檢測(cè)24小時(shí)尿蛋白定量。鹽酸貝那普利組按10mg/kg/d給藥，用3ml蒸餾水配成混懸液灌胃+生理鹽水1.5ml/只腹腔注射；丹參多酚酸鹽低、中、高劑量組分別按16.7mg/kg/d、33.3mg/kg/d、66.7mg/kg/d腹腔注射，注射前用1.5ml生理鹽水配成溶液+蒸餾水3ml/只灌胃；正常組、模型組均給予蒸餾水3ml/只灌胃+生理鹽水1.5ml/只腹

6、腔注射。每天1次，連續(xù)4周。各組大鼠自由進(jìn)食、飲水。連續(xù)治療4周后再次代謝籠內(nèi)留取各組大鼠24小時(shí)尿液，檢測(cè)24小時(shí)尿蛋白定量。之后腹腔注射麻醉，股動(dòng)脈取血，檢測(cè)各組大鼠TP、ALB、TC、TG、BUN、Scr等指標(biāo)，摘腎留腎組織分別做光鏡、電鏡、免疫熒光，觀察腎小球基底膜、足突及免疫復(fù)合物沉積情況；做免疫組化、real-time PCR檢測(cè)CD2AP及Desmin蛋白在腎組織的表達(dá)情況，并用病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。
　　

7、結(jié)果：
　　1.24小時(shí)尿蛋白定量:連續(xù)尾靜脈注射C-BSA4周后，除正常組外，其余各組大鼠均出現(xiàn)大量蛋白尿，與正常組相比均有顯著差異。連續(xù)給藥4周后，鹽酸貝那普利組及丹參多酚酸鹽各劑量組大鼠尿蛋白定量均有明顯下降，與模型組相比有明顯差異；丹參多酚酸鹽各劑量組與鹽酸貝那普利組相比差異不明顯，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與低劑量丹參多酚酸鹽組相比，中高劑量組尿蛋白定量下降更明顯，以丹參多酚酸鹽高劑量組下降最明顯，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.各

8、生化指標(biāo)檢測(cè)：模型組、鹽酸貝那普利組、低中高劑量丹參多酚酸鹽組與正常組相比，血清TP、ALB均明顯降低而TC、TG均明顯升高，差異顯著；鹽酸貝那普利組、低中高劑量丹參多酚酸鹽組與模型組相比血清TP、ALB均明顯升高而TC、TG均明顯降低，差異顯著；低中高劑量丹參多酚酸鹽組與鹽酸貝那普利組相比結(jié)果差異不明顯，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與低劑量丹參多酚酸鹽組相比，中高劑量組血清TP、ALB升高更明顯，TC、TG降低更明顯，以丹參多酚酸鹽高劑量組改變最明

9、顯，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組大鼠血清 BUN、Scr比較，結(jié)果差異不明顯，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.腎組織病理形態(tài)學(xué)觀察
　　光鏡顯示：正常組大鼠腎小球形態(tài)結(jié)構(gòu)無(wú)明顯異常，無(wú)基底膜增厚；模型組大鼠腎小球基底膜上皮下有明顯的嗜復(fù)紅蛋白沉積，腎小球基底膜彌漫顯著增厚，腎小球基底膜外側(cè)“釘突”形成；鹽酸貝那普利組及丹參多酚酸鹽各劑量組大鼠腎小球上皮下少量嗜復(fù)紅蛋白沉積，腎小球基底膜增厚較模型組輕，“釘突”形成亦較模型組少。
　　電

10、鏡顯示：正常組大鼠腎小球足細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，足突排列整齊；模型組大鼠腎小球基底膜上皮下多數(shù)電子致密物沉積、體積較大，足細(xì)胞足突廣泛融合或消失；鹽酸貝那普利組及丹參多酚酸鹽各劑量組大鼠腎小球基底膜上皮下少量電子致密物沉積、體積較小，腎小球基底膜輕度增厚，足細(xì)胞足突部分融合。
　　免疫熒光：正常組大鼠腎小球無(wú)明顯變化，無(wú)熒光表現(xiàn)；模型組大鼠可見(jiàn)免疫球蛋白IgG及補(bǔ)體C3沿毛細(xì)血管袢大量分布，熒光強(qiáng)度明顯；鹽酸貝那普利組及丹參多酚酸鹽各劑量

11、組可見(jiàn)少量IgG、C3呈顆粒狀沿毛細(xì)血管袢沉積，且熒光強(qiáng)度較弱。
　　免疫組化：從免疫組化染色中可以看到CD2AP蛋白表達(dá)于腎小球上皮下。在正常組大鼠腎小球上大量表達(dá)，沿著毛細(xì)血管袢呈線樣分布，染色最強(qiáng)；在模型組大鼠可見(jiàn)其沿著毛細(xì)血管袢呈顆粒樣或斑片狀分布，染色強(qiáng)度明顯減弱，較正常組表達(dá)明顯減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；鹽酸貝那普利組及丹參多酚酸鹽各劑量組可見(jiàn)其沿著毛細(xì)血管袢不連續(xù)性線狀呈斑片狀分布，染色強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，均較模型組表達(dá)明顯增多

12、，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；丹參多酚酸鹽各劑量組與鹽酸貝那普利組相比染色強(qiáng)度無(wú)明顯差異；與低劑量丹參多酚酸鹽組相比，中高劑量組染色強(qiáng)度更強(qiáng)，且以高劑量丹參多酚酸鹽組染色強(qiáng)度最強(qiáng),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　Desmin蛋白主要表達(dá)在系膜細(xì)胞上，免疫組化染色可見(jiàn)其在正常組大鼠腎小球上微弱表達(dá)。與正常組相比，模型組大鼠腎小球內(nèi)Desmin蛋白在毛細(xì)血管壁沿基底膜出現(xiàn)了較強(qiáng)的陽(yáng)性表達(dá)，呈線性分布，Desmin蛋白表達(dá)顯著增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與模型組相比，

13、鹽酸貝那普利組及丹參多酚酸鹽各劑量組陽(yáng)性染色弱于模型組， Desmin蛋白表達(dá)減少，有顯著性差異；丹參多酚酸鹽各劑量組與鹽酸貝那普利組相比染色強(qiáng)度無(wú)明顯差異；與低劑量丹參多酚酸鹽組相比，中高劑量組染色強(qiáng)度更弱，且以高劑量丹參多酚酸鹽組染色強(qiáng)度最弱,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4.腎組織中CD2AP mRNA和Desmin mRNA的表達(dá)情況:統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組CD2AP mRNA的表達(dá)明顯減少，差異顯著；與模型組相

14、比，鹽酸貝那普利組及丹參多酚酸鹽各劑量組CD2AP mRNA表達(dá)均明顯增多，差異顯著；丹參多酚酸鹽各劑量組與鹽酸貝那普利組相比差異不明顯；與低劑量丹參多酚酸鹽組相比，中高劑量組增多更明顯，以丹參多酚酸鹽高劑量組增多最明顯，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與正常組相比，模型組Desmin mRNA的表達(dá)明顯增多，差異顯著；與模型組相比，鹽酸貝那普利組及丹參多酚酸鹽各劑量組Desmin mRNA的表達(dá)均有所減少，差異顯著；丹參多酚酸鹽各劑量組與鹽酸貝那普利

15、組相比差異不明顯；與低劑量丹參多酚酸鹽組相比，中高劑量組減少更明顯，以丹參多酚酸鹽高劑量組減少最明顯，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1.膜性腎病大鼠CD2AP表達(dá)減少，Desmin表達(dá)增多，并與蛋白尿多少、腎臟病理表現(xiàn)程度變化一致，提示CD2AP和Desmin參與了膜性腎病足細(xì)胞的損傷和蛋白尿的產(chǎn)生。
　　2.丹參多酚酸鹽可以降低膜性腎病大鼠24h尿蛋白定量，升高血清TP、ALB水平，降低TC、TG水平。