大鼠腎缺血后處理對(duì)熱休克蛋白表達(dá)的影響及作用.pdf

1、目的：觀察大鼠腎臟缺血后處理熱休克蛋白(HSP)70、HSP27、HSP32(HO-1)表達(dá)的變化及對(duì)腎臟缺血再灌注損傷的影響，探討缺血后處理減輕腎臟缺血再灌注損傷的機(jī)制。
　　 方法：健康雄性SD大鼠140只，體重250g～2809，隨機(jī)分為4組，每組7個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只(n=5)：假手術(shù)組（S組）；缺血再灌注組（I/R組）；后處理組（Ipo組）；槲皮黃酮(Quercetin)+后處理組(Q+Ipo組)。
　　

2、10％水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉，用無損傷動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)腎蒂，腎臟顏色變?yōu)榘导t色即可確認(rèn)腎臟血流阻斷，造成雙側(cè)腎缺血，45min后松開動(dòng)脈夾，腎臟由暗紅色恢復(fù)鮮紅色即可確認(rèn)血流恢復(fù)，同時(shí)記錄再灌注時(shí)間。夾閉和放開腎蒂時(shí)腹腔內(nèi)各注射林格液20ml/kg。S組僅行開腹，游離出雙側(cè)腎臟，分離雙側(cè)腎蒂不夾閉，傷口用生理鹽水紗布覆蓋，暴露45min不作腎缺血處理；I/R組夾閉雙側(cè)腎蒂，缺血45min后放開動(dòng)脈夾；Ipo組在夾閉雙側(cè)腎蒂45m

3、in后，再灌注10s，缺血10s，反復(fù)3次，再全面恢復(fù)血液灌注；Q+Ipo組缺血前1h腹腔注射槲皮黃酮100mg.kg-1，余同Ipo組。再灌注即刻(T0)、1h(T1)、3h(T2)、6h(T3)、12h(T4)、24h(T5)、48h(T6)分別處死大鼠取材。
　　 熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR法測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)腎組織HSP70mRNA、HSP27mRNA和HO-1mRNA的表達(dá)，免疫組化法測(cè)定HSP70、HSP27和HO-1蛋白的

4、表達(dá)；再灌注6h(T3)時(shí)酶法測(cè)定血清肌酐(Cr)含量，苦味酸不除蛋白法測(cè)定血清尿素氮(BUN)含量；硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定腎組織中MDA含量和黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性；TUNEL法測(cè)定腎組織中細(xì)胞的凋亡；熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR法測(cè)定caspase-3mRNA的表達(dá)；用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)TNF-α的表達(dá)；免疫組化法測(cè)定NF-κB的表達(dá)。
　　 結(jié)果：HSP70mRNA和HSP70蛋白的表達(dá)：S組HSP7

5、0mRNA有微量表達(dá)，HSP70蛋白幾乎無表達(dá)，其余各組均在T0時(shí)開始表達(dá)，逐漸升高，T3時(shí)達(dá)高峰，隨后逐漸下降。與S組比較，其余各組各時(shí)間點(diǎn)HSP70mRNA和HSP70蛋白表達(dá)均明顯升高(P＜0.05)；與I/R組比較，Ipo組T1時(shí)HSP70mRNA表達(dá)升高，T2～T5時(shí)HSP70mRNA和HSP70蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.05)，T3時(shí)的峰值升高(P＜0.05)，T6時(shí)HSP70蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，Q+I

6、po組各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；與Ipo組比較，Q+Ipo組T2～T5時(shí)HSP70mRNA和HSP70蛋白表達(dá)降低(P＜0.05)，T3時(shí)的峰值降低(P＜0.05)，T6時(shí)HSP70蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 HO-1mRNA和HO-1蛋白的表達(dá)：S組HO-1mRNA有微量表達(dá)，HO-1蛋白幾乎無表達(dá)，其余各組均在T0時(shí)開始表達(dá)，逐漸升高，T3時(shí)達(dá)高峰，隨后逐漸下降。與S組比較，其余各組

7、各時(shí)間點(diǎn)HO-1mRNA和HO-1蛋白表達(dá)均明顯升高(P＜0.05)；與I/R組比較，Ipo組T1時(shí)HO-1mRNA表達(dá)升高，T2～T5時(shí)HO-1mRNA和HO-1蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.05)，T3時(shí)的峰值升高(P＜0.05)，T6時(shí)HO-1蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，Q+Ipo組各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與Ipo組比較，Q+Ipo組T2～T5時(shí)HO-1mRNA和HO-1蛋白表達(dá)降低(P＜0.05)

8、，T3時(shí)的峰值降低(P＜0.05)，T6時(shí)HO-1蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 HSP27mRNA和HSP27蛋白的表達(dá)：S組HSP27mRNA有微量表達(dá)，HSP27蛋白幾乎無表達(dá)，其余各組均在T0時(shí)開始表達(dá)，逐漸升高，T3時(shí)達(dá)高峰，隨后逐漸下降。與S組比較，其余各組各時(shí)間點(diǎn)HSP27mRNA和HSP27蛋白表達(dá)均明顯升高（P＜0.05）；與I/R組比較，Ipo組T2～T5時(shí)HSP27mRNA和HSP27蛋白

9、表達(dá)顯著升高(P＜0.05)，T3時(shí)的峰值升高(P＜0.05)，T6時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，Q+Ipo組各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與Ipo組比較，Q+Ipo組T2～T5時(shí)HSP27mRNA和HSP27蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），T3時(shí)的峰值降低(P＜0.05)，T6時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 再灌注6h血清Cr和BUN濃度、caspase-3mRNA、AI及病理學(xué)結(jié)果：與S組比較

10、，其余各組血清Cr和BUN濃度升高，caspase-3mRNA、AI升高(P＜0.05)，腎損傷明顯；與I/R組比較，Ipo組血清Cr和BUN濃度降低，caspase-3mRNA、AI降低(P＜0.05)，腎損傷減輕；與Ipo組比較，Q+Ipo組血清Cr和BUN濃度升高，caspase-3mRNA、AI升高(P＜0.05)，腎損傷加重；Q+Ipo組與I/R組比較各指標(biāo)無明顯差異。
　　 腎組織SOD活性、MDA含量、NF-κB表

11、達(dá)和血漿TNF-α水平：與S組比較，其余各組腎組織SOD活性降低，MDA含量升高，腎小管上皮細(xì)胞NF-κB表達(dá)和血漿TNF-α水平升高(P＜0.05)；與I/R組比較，Ipo組腎組織SOD活性升高，MDA含量降低，腎小管上皮細(xì)胞NF-κB表達(dá)和血漿TNF-α水平降低(P＜0.05)；與Ipo組比較，Q+Ipo組腎組織SOD活性降低，MDA含量升高，腎小管上皮細(xì)胞NF-κB表達(dá)和血漿TNF-α水平升高(P＜0.05)；Q+Ipo組與I/R