缺氧預(yù)處理對(duì)顱腦外傷大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白P-eIF2α、GADD34表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、課題背景：
　　戰(zhàn)爭即有傷亡，顱腦外傷（Traumatic Brain Injury，TBI）是士兵眾多戰(zhàn)傷類型中的主要損傷形式之一，甚者是致死的重要原因，具有表現(xiàn)形式多樣、病情發(fā)展迅速、死亡率高、預(yù)后差異性大等眾多特點(diǎn)?，F(xiàn)已逐漸成為各大軍事及地方醫(yī)學(xué)院、研究所等機(jī)構(gòu)研究的重要領(lǐng)域。隨著科學(xué)技術(shù)水平的不斷發(fā)展和進(jìn)步，交通工具尤其是汽車的使用率逐漸增加，使得TBI的發(fā)生率逐年上升。因無法干預(yù)顱腦外傷相關(guān)直接作用力的情況下，尋找能最大

2、程度降低外傷后腦組織繼發(fā)性損害的方法，如炎性應(yīng)激、氧化應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等，為臨床中提高顱腦外傷患者的救治率、降低死亡率以及最大程度降低傷殘率等方面，都有著重要的意義。缺氧預(yù)處理（Hypoxic preconditioning，HPC）是指通過提前給予一定程度適當(dāng)?shù)牡脱跤?xùn)練，可以顯著的增強(qiáng)機(jī)體各組織，尤其是腦組織對(duì)于隨后突發(fā)的各種缺血、缺氧等打擊的耐受能力，提高自身的防護(hù)，從而發(fā)揮重要的神經(jīng)保護(hù)，抗缺血、缺氧等造成的應(yīng)激損傷能力。磷酸化的

3、真核翻譯起始因子2α(Phosphorylated eukaryotic translation initiation factor2 alpha，P-eIF2α)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（Endoplasmic Reticulum Stress，ERS）時(shí)由eIF2α發(fā)生磷酸化產(chǎn)生，磷酸化后導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)合成受到阻礙。當(dāng)ERS持續(xù)發(fā)生時(shí)，P-eIF2α持續(xù)生成，導(dǎo)致正常功能的蛋白質(zhì)合成嚴(yán)重受阻，然而可以選擇性的合成細(xì)胞凋亡基因，最終導(dǎo)致細(xì)胞走

4、向凋亡或壞死。生長停滯與DNA損害可誘導(dǎo)蛋白34（Growth arrest and DNA damage-inducible protein34，GADD34）是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程中的重要分子，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)合成受阻后的再啟動(dòng)。研究缺氧預(yù)處理對(duì)顱腦外傷中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其相關(guān)凋亡的變化規(guī)律，可促進(jìn)改善顱腦外傷后神經(jīng)元損傷、凋亡及行為認(rèn)知功能，為臨床工作中提高對(duì)TBI的救治提供有利的基礎(chǔ)理論支持。
　　第一部分缺氧預(yù)處理對(duì)顱腦外傷大鼠

5、皮層內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白P-eIF2α表達(dá)及神經(jīng)元凋亡影響的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：
　　（1）觀察顱腦外傷后大鼠腦組織病理改變及缺氧預(yù)處理對(duì)其改變的影響；
　?。?）探討缺氧預(yù)處理對(duì)顱腦外傷大鼠皮層腦組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白P-eIF2α表達(dá)變化及神經(jīng)元凋亡的影響。
　　方法：
　　208只成年雄性SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為以下4個(gè)實(shí)驗(yàn)組：對(duì)照（Con）組、缺氧預(yù)處理（HPC）組、外傷（TBI）組、缺氧預(yù)處理顱腦外傷（

6、HPCT）組。TBI組與HPCT組進(jìn)一步分為：1h、3h、6h、12h和24h、3d、7d、14d時(shí)間點(diǎn)共8個(gè)亞組。Con組僅進(jìn)行頭皮切開及縫合處理，隨后處死。采用改良的Feeney’s法自由落體腦損傷打擊方法制作顱腦外傷大鼠動(dòng)物模型。打擊點(diǎn)定位于：前囟門后3.0mm，且中線左側(cè)旁開3.0mm處，骨窗直徑約5.0mm；打擊重量及高度：50g砝碼，垂直高度為25cm處自由落下撞擊骨窗，打擊深度約3-4mm。缺氧預(yù)處理模型是在顱腦外傷打擊前

7、在低壓氧倉內(nèi)預(yù)先給予適當(dāng)?shù)娜毖跤?xùn)練（-50.47 KPa，3h/d，連續(xù)3d）。采用HE染色法和制作新鮮腦組織標(biāo)本超薄切片，分別在光鏡和電鏡下觀察各組大鼠腦組織大體結(jié)構(gòu)和神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變；免疫組化法和Western Blotting法檢測挫傷部位周圍皮層腦組織中P-eIF2α蛋白的表達(dá)變化，以及TUNEL染色法檢測神經(jīng)元凋亡變化情況。
　　結(jié)果：
　?。?）Con組和HPC組光鏡和電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)腦組織大體及微觀結(jié)構(gòu)無明

8、顯改變， HPCT組較TBI組大鼠腦組織光鏡下改變明顯減輕，電鏡下神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)受損減輕，完整性保持較好，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)受損減輕。
　　（2）免疫組化染色及Western Botting法檢測發(fā)現(xiàn)，P-eIF2α蛋白在顱腦外傷后3h表達(dá)開始增加，傷后6h-12h時(shí)間段表達(dá)呈上升趨勢，在傷后24h達(dá)到高峰，隨后在3d-14d逐漸下降；其中，傷后6h-7d時(shí)間段P-eIF2α蛋白表達(dá)HPCT組較TBI組顯著下降，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)

9、意義(P＜0.05)。TUNEL染色觀察神經(jīng)元凋亡情況發(fā)現(xiàn)，傷后6h TBI組和HPCT組凋亡細(xì)胞逐漸開始表達(dá)，傷后12h-24h凋亡細(xì)胞數(shù)逐漸增加，傷后3d達(dá)高峰，隨后在傷后7d-14d逐漸恢復(fù)。其中，HPCT組較TBI組在傷后12h-7d時(shí)間凋亡細(xì)胞數(shù)明顯下降，凋亡率顯著降低，兩組比較差異具有顯著性意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　?。?）缺氧預(yù)處理可顯著降低大鼠顱腦外傷后腦組織病理改變，較好的維持神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

10、的完整性，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷。
　　（2）缺氧預(yù)處理可通過選擇性抑制顱腦外傷大鼠皮層內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白P-eIF2α的表達(dá)，減輕ERS引起的損傷，降低神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，繼而促進(jìn)細(xì)胞存活并維持神經(jīng)元功能的穩(wěn)定。
　　第二部分缺氧預(yù)處理對(duì)顱腦外傷大鼠海馬GADD34表達(dá)及行為學(xué)影響的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：
　　探討缺氧預(yù)處理對(duì)顱腦外傷大鼠海馬GADD34表達(dá)及行為學(xué)變化的影響，研究缺氧預(yù)處理參與減低顱腦外傷后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷的機(jī)制

11、。
　　方法：
　　清潔新西蘭SD雄性大鼠共48只，使用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照（Con）組，缺氧預(yù)處理（HPC）組，顱腦外傷（TBI）組，缺氧預(yù)處理顱腦外傷（HPCT）組。大鼠顱腦外傷模型采用改良的自由落體裝置制作，預(yù)先將大鼠在低壓氧倉(-50.47 kPa)內(nèi)訓(xùn)練3小時(shí)/天、連續(xù)3天來制作缺氧預(yù)處理動(dòng)物模型。四組大鼠均在傷后24h處死并留取相應(yīng)標(biāo)本。采用改良Sugrwara法對(duì)大鼠傷后24h行為學(xué)進(jìn)行評(píng)估；采用RT-PCR、

12、蛋白免疫印跡（Western Blotting）法以及免疫組化染色檢測顱腦外傷大鼠海馬組織中GADD34 mRNA和蛋白的表達(dá)變化，以及TUNEL染色觀察神經(jīng)元凋亡變化情況。
　　結(jié)果：
　　RT-PCR、蛋白免疫印跡和免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，HPCT組大鼠海馬組織中GADD34 mRNA及蛋白表達(dá)較TBI組顯著增高,兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而且，外傷后24h行為學(xué)評(píng)分HPCT組大鼠明顯高于TBI組，兩組進(jìn)行比