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文檔簡介
1、目的:肝細(xì)胞癌(HCC)已成為中國最常見的惡性腫瘤之一。近年來,肝癌研究已取得了顯著的成果,特別是在基因水平上的研究。然而,由于肝癌發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性,其研究進(jìn)展仍然十分有限。5-氮雜-2'-脫氧胞苷(AZA)是一種DNA甲基化抑制劑,目前不僅用于血液惡性腫瘤的治療,如急性白血病、骨髓增生異常綜合征等,也可用于其他實體腫瘤的治療。反義RNA是一種普遍存在的內(nèi)源性調(diào)節(jié)RNA。它是第一個被發(fā)現(xiàn)具有抑制功能的RNA分子。研究發(fā)現(xiàn)其功能不僅與轉(zhuǎn)錄
2、后調(diào)控有關(guān),而且與轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控相關(guān),包括表觀遺傳調(diào)控,如DNA甲基化和組蛋白修飾。轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控主要是由轉(zhuǎn)錄抑制和染色質(zhì)重塑引起的,轉(zhuǎn)錄后調(diào)控主要與RNA的相互作用有關(guān)。反義RNA在各種生理和病理過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用,如器官發(fā)生、細(xì)胞分化和疾病進(jìn)展等。大多數(shù)基因可以轉(zhuǎn)錄反義RNA。一些研究證實,老鼠和人類有大量反義轉(zhuǎn)錄本。幾個實驗室已建立的方法篩選反義RNA,如Quere等應(yīng)用高通量SAGE結(jié)合生物信息學(xué)識別反義RNA?;蚪M轉(zhuǎn)錄子的
3、生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),異常反義RNAs會影響基因的正常表達(dá)。例如,p15反義RNA可通過影響DNA甲基化和組蛋白修飾,抑制p15基因的表達(dá)。
方法:我們首先構(gòu)建雙鏈cDNA文庫,然后從建立的雙鏈cDNA文庫中篩選出與肝癌相關(guān)的反義RNAs,并驗證三個基因的反義RNA,最后,通過全長序列的cDNA末端擴(kuò)增技術(shù)(RACE)的鑒定全長反義RNA序列。
結(jié)果:在已建立的雙鏈cDNA的情況下選取3個基因進(jìn)行驗證,經(jīng)過一系列實驗,
4、結(jié)果如下:
(1)利用鏈特異性逆轉(zhuǎn)錄引物和PCR分析,確認(rèn)MEF2D、CDK16、SMARCA4三個癌相關(guān)基因確實存在正反義RNA;
(2)利用實時熒光定量PCR技術(shù)分析發(fā)現(xiàn),DNA甲基化酶抑制劑AZA處理可顯著降低癌相關(guān)基因MEF2D、CDK16、SMARCA4的表達(dá)(P<0.05),提高它們的反義RNA的表達(dá)(P<0.01);
(3)采用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)獲得MEF2D基因反義RNA全長序列;
5、r> (4)用ORF finder軟件對MEF2D基因反義RNA開放閱讀框進(jìn)行預(yù)測,發(fā)現(xiàn)此轉(zhuǎn)錄子沒有明顯開放閱讀框。由此我們推斷其可能是一個長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)。
結(jié)論:(1) MEF2D、CDK16、SMARCA4基因確實存在雙鏈RNA且所選基因正反義RNA是反相關(guān)關(guān)系。
(2) DNA甲基化抑制劑AZA可能通過激活癌相關(guān)基因反義RNA從而下調(diào)癌相關(guān)基因起到抗癌作
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