5-氮雜-2＇-脫氧胞苷抗癌新機(jī)制及肝癌細(xì)胞相關(guān)反義RNA鑒定研究.pdf

1、目的:肝細(xì)胞癌(HCC)已成為中國最常見的惡性腫瘤之一。近年來，肝癌研究已取得了顯著的成果，特別是在基因水平上的研究。然而，由于肝癌發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，其研究進(jìn)展仍然十分有限。5-氮雜-2'-脫氧胞苷(AZA)是一種DNA甲基化抑制劑，目前不僅用于血液惡性腫瘤的治療，如急性白血病、骨髓增生異常綜合征等，也可用于其他實體腫瘤的治療。反義RNA是一種普遍存在的內(nèi)源性調(diào)節(jié)RNA。它是第一個被發(fā)現(xiàn)具有抑制功能的RNA分子。研究發(fā)現(xiàn)其功能不僅與轉(zhuǎn)錄

2、后調(diào)控有關(guān)，而且與轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控相關(guān)，包括表觀遺傳調(diào)控，如DNA甲基化和組蛋白修飾。轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控主要是由轉(zhuǎn)錄抑制和染色質(zhì)重塑引起的，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控主要與RNA的相互作用有關(guān)。反義RNA在各種生理和病理過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，如器官發(fā)生、細(xì)胞分化和疾病進(jìn)展等。大多數(shù)基因可以轉(zhuǎn)錄反義RNA。一些研究證實，老鼠和人類有大量反義轉(zhuǎn)錄本。幾個實驗室已建立的方法篩選反義RNA，如Quere等應(yīng)用高通量SAGE結(jié)合生物信息學(xué)識別反義RNA?；蚪M轉(zhuǎn)錄子的

3、生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，異常反義RNAs會影響基因的正常表達(dá)。例如，p15反義RNA可通過影響DNA甲基化和組蛋白修飾，抑制p15基因的表達(dá)。
　　方法:我們首先構(gòu)建雙鏈cDNA文庫，然后從建立的雙鏈cDNA文庫中篩選出與肝癌相關(guān)的反義RNAs，并驗證三個基因的反義RNA，最后，通過全長序列的cDNA末端擴(kuò)增技術(shù)(RACE)的鑒定全長反義RNA序列。
　　結(jié)果:在已建立的雙鏈cDNA的情況下選取3個基因進(jìn)行驗證，經(jīng)過一系列實驗，

4、結(jié)果如下:
　　(1)利用鏈特異性逆轉(zhuǎn)錄引物和PCR分析，確認(rèn)MEF2D、CDK16、SMARCA4三個癌相關(guān)基因確實存在正反義RNA;
　　(2)利用實時熒光定量PCR技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化酶抑制劑AZA處理可顯著降低癌相關(guān)基因MEF2D、CDK16、SMARCA4的表達(dá)(P＜0.05)，提高它們的反義RNA的表達(dá)(P＜0.01);
　　(3)采用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)獲得MEF2D基因反義RNA全長序列;

5、r>　　(4)用ORF finder軟件對MEF2D基因反義RNA開放閱讀框進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)此轉(zhuǎn)錄子沒有明顯開放閱讀框。由此我們推斷其可能是一個長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)。
　　結(jié)論:(1) MEF2D、CDK16、SMARCA4基因確實存在雙鏈RNA且所選基因正反義RNA是反相關(guān)關(guān)系。
　　(2) DNA甲基化抑制劑AZA可能通過激活癌相關(guān)基因反義RNA從而下調(diào)癌相關(guān)基因起到抗癌作