5-氮胞苷體外誘導(dǎo)人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞心肌樣分化及機(jī)制研究.pdf

1、目的：探討5-氮胞苷誘導(dǎo)人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cordmesenchyrmal stem cells,hucMSCs)體外向心肌樣細(xì)胞分化的生物學(xué)特點(diǎn),并初步揭示誘導(dǎo)分化的可能機(jī)制。
　　 方法：采用組織塊貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)hucMSCs。體外經(jīng)5-氮胞苷(5-Azacytidine,5-Aza)誘導(dǎo)第2代hucMSCs向心肌樣分化；通過透射電鏡、RT-PCR、免疫組化、實(shí)時熒光定量RT-PCR及We

2、stern blot等方法鑒定心肌樣細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu),心肌特異性基因及蛋白表達(dá),干細(xì)胞標(biāo)志變化等。采用Western blot方法分析誘導(dǎo)分化過程中ERK及PKC相關(guān)信號分子通路的變化并用相應(yīng)抑制劑阻斷信號分子通路,進(jìn)一步觀察5-Aza誘導(dǎo)后hucMSCs中基因及蛋白的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：經(jīng)5-Aza體外誘導(dǎo)hucMSCs向心肌樣細(xì)胞分化,RT-PCR顯示誘導(dǎo)組細(xì)胞結(jié)蛋白(desmin)表達(dá)顯著增加并表達(dá)心肌特異性標(biāo)志如β-肌

3、球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain)、心肌鈣蛋白T(cardiac troponinT)、心鈉素(A—type natriuretic peptide)、Nkx2.5,免疫組化呈結(jié)蛋白、心肌鈣蛋白強(qiáng)陽性；在透射電鏡下,誘導(dǎo)后細(xì)胞具有條索狀肌絲形成。實(shí)時熒光定量RT—PCR及Western blot顯示干細(xì)胞標(biāo)志物Nanog、Oct4、Sox2、Sall4在5-Aza誘導(dǎo)后的hucMSCs中mRNA及蛋白水平均顯著下降。

4、隨誘導(dǎo)時間延長,誘導(dǎo)后hucMSCs中ERK磷酸化水平逐漸增加,而PKC無明顯變化。使用MEK通路抑制劑U0126作用后,誘導(dǎo)后hucMSCs產(chǎn)生的相關(guān)心肌特異性基因及蛋白表達(dá)顯著減少,且STAT3磷酸化水平及MEF-2c、MyoD的蛋白表達(dá)明顯受到抑制。5-Aza誘導(dǎo)人肺成纖維細(xì)胞(human diploid lung fibroblasts,HFL1)兩周后不表達(dá)心肌相關(guān)及特異性基因,且5-Aza不能誘導(dǎo)hucMSCs向成骨細(xì)胞分化