多沙唑嗪的SPE-LC-MS-MS分析方法建立及其在大鼠體內(nèi)代謝的研究.pdf

1、多沙唑嗪中文全稱為甲磺酸多沙唑嗪（DOX）屬喹啉類高選擇性α1腎上腺素受體阻斷劑，是臨床上用于治療良性前列腺增生合并下尿路癥狀的一線藥物，也是高血壓治療推薦方案中的常用添加藥物。多沙唑嗪分子結(jié)構(gòu)中存在一個手性碳原子，為手性藥物，臨床應(yīng)用其消旋體（由等量左旋多沙唑嗪和右旋多沙唑嗪組成）。動物實驗研究表明，兩個對映體在藥代動力學(xué)、藥理作用和毒性作用方面有明顯的手性差異；在治療良性前列腺增生方面，左旋多沙唑嗪可能具有一定的優(yōu)勢。
　　眾

2、所周知，藥物的效應(yīng)與血液中藥物的濃度有密切關(guān)系，多沙唑嗪亦是如此。研究表明生物體內(nèi)多沙唑嗪作為α1受體阻斷劑的藥理作用與血中多沙唑嗪的濃度有直接關(guān)系。另外，血藥濃度監(jiān)測可以為臨床合理、安全用藥提供依據(jù)。隨著儀器分析技術(shù)的發(fā)展，越來越多的新技術(shù)被用于藥物血藥濃度的檢測，推動了體內(nèi)藥代動力學(xué)的發(fā)展。尤為重要的是質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，為藥物代謝動力學(xué)及代謝組學(xué)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。
　　生物樣品中多沙唑嗪的含量測定，多采用HPLC-UVD、HPL

3、C-FLD、HPLC-MS方法，但最低定量限均未超過0.1 ng·mL/1。然而，對于多沙唑嗪藥代動力學(xué)研究需要更低的血藥濃度和更靈敏的多沙唑嗪血藥濃度檢測方法。本文建立了大鼠血漿左旋多沙唑嗪微量檢測的SPE-LC-MS/MS方法，最低定量限為10.4 pg·mL/1，該法同樣適用于右旋多沙唑嗪及消旋多沙唑嗪生物樣本的檢測。同時，采用 LC-MS/MS法對消旋多沙唑嗪靜脈注射后在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)及代謝產(chǎn)物進(jìn)行了研究。
　　第一

4、部分大鼠血漿中左旋多沙唑嗪SPE-LC-MS/MS分析方法的建立
　　目的：目前多沙唑嗪及其對映體的生物樣本最低定量限未超過0.1 ng·mL/1，本研究建立了一種新的大鼠血漿左旋多沙唑嗪微量檢測的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）方法。
　　方法：血漿樣本加入內(nèi)標(biāo)哌唑嗪后經(jīng) C18固相萃取小柱萃取，堿性條件下采用ACQUITY BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7μm）色譜柱進(jìn)行分離，流速為0.45 mL·

5、min/1。在正離子模式下以MRM（多反應(yīng)離子監(jiān)測）方式測定左旋多沙唑嗪的含量。
　　結(jié)果：左旋多沙唑嗪和內(nèi)標(biāo)物分離良好，保留時間分別為0.47和0.35 min，且血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾左旋多沙唑嗪及內(nèi)標(biāo)物的測定。左旋多沙唑嗪在10.4 pg·mL-1~13 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低定量限為10.4 pg·mL-1。采用提取后加入法及柱后灌注法評價左旋多沙唑嗪血漿樣本的基質(zhì)效應(yīng)，不存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)。應(yīng)用本法可測定

6、大鼠尾靜脈注射左旋多沙唑嗪（3 mg·kg-1）48 h后的血藥濃度，結(jié)果為0.0344±0.0102 ng·mL-1。
　　結(jié)論：所建立的SPE-LC-MS/MS分析方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，適用于左旋多沙唑嗪的血藥濃度測定，也為其他藥物血藥濃度的分析提供了參考。
　　第二部分大鼠靜脈注射消旋多沙唑嗪的藥代動力學(xué)及其代謝產(chǎn)物研究
　　目的：研究大鼠靜脈注射消旋多沙唑嗪的藥代動力學(xué)，采用LC-MSn方法鑒定大鼠體內(nèi)消旋多

7、沙唑嗪的代謝產(chǎn)物。
　　方法：消旋多沙唑嗪藥代動力學(xué)研究：取SD大鼠6只，靜脈注射消旋多沙唑嗪溶液（0.686 mg·kg-1）后，于給藥后不同時間用肝素化毛細(xì)管經(jīng)大鼠眼底靜脈叢取血，血樣采集時間為72 h。采用液液萃取法進(jìn)行血漿樣品預(yù)處理，萃取溶液為正己烷-乙酸乙酯（1:1 v/v）混合溶液。應(yīng)用高靈敏度的UPLC-MS/MS方法測定每一受試動物各取血點的血藥濃度。色譜條件：Hypersil Gold C18（100 mm×2.

8、1 mm，1.9μm）色譜柱，柱溫35℃；流動相乙腈-0.1％甲酸水溶液，梯度洗脫方式；流速0.35 mL·min-1。WinNonlin5.1軟件進(jìn)行藥時曲線擬合，并采用靜脈單次給藥及雙房室模型計算消旋多沙唑嗪藥代動力學(xué)參數(shù)。消旋多沙唑嗪代謝產(chǎn)物研究：用高分辨質(zhì)譜 Orbitrap Fusion技術(shù)對消旋多沙唑嗪在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。
　　結(jié)果：采用雙房室模型計算大鼠靜脈注射消旋多沙唑嗪的藥代動力學(xué)參數(shù)，消旋多沙唑嗪的主

9、要藥代動力學(xué)參數(shù) t1/2β為（1.44±0.27）h， AUC0-t為（403.63±50.88）h·ng·mL-1，其中t1/2β與本實驗室前期研究結(jié)果t1/2β（1.41±0.15）h基本一致。共檢測到9個代謝產(chǎn)物：3個單羥基化產(chǎn)物、1個氧去甲基產(chǎn)物、1個哌嗪環(huán)羥基化后脫水產(chǎn)物，此外還發(fā)現(xiàn)了M4(m/z451.1612)、M5(m/z470.2034)、M6(m/z466.1721)、M7(m/z422.1459)產(chǎn)物。其中羥基化

10、、氧去甲基、哌嗪環(huán)羥基化后脫水產(chǎn)物已有報道；M4-M7為首次發(fā)現(xiàn)。原形藥消旋多沙唑嗪經(jīng)過哌嗪環(huán)羥基化后脫水、羥基化和脫氨基反應(yīng)生成M4；苯并二噁烷環(huán)羥基化后開環(huán)生成M5；哌嗪環(huán)羥基化后脫水和羥基化反應(yīng)生成M6；哌嗪環(huán)羥基化后脫水和氧去甲基反應(yīng)生成M7。
　　結(jié)論：延長血漿樣本采集時間至48 h時，大鼠體內(nèi)消旋多沙唑嗪消除半衰期與文獻(xiàn)報道一致；同時在大鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了未曾報道的4個可能的代謝產(chǎn)物（M4-M7），其代謝修飾過程比已知代謝物