基于LC-MS代謝組學技術(shù)的肺癌細胞氨基酸代謝足跡分析方法建立及應用.pdf

1、代謝組學主要考察生物體系受擾動（環(huán)境因素、遺傳因素等）條件下的代謝物種類及數(shù)量上的變化情況，是系統(tǒng)生物學的重要組成部分。從研究內(nèi)容而言，代謝組學可分為代謝指紋分析和代謝足跡分析，其中代謝足跡分析（Metabolic footprinting analysis）考察生物體細胞外介質(zhì)代謝組特征，通過分析組織細胞對環(huán)境/培養(yǎng)基中營養(yǎng)物的消耗以及代謝物分泌情況，可實時動態(tài)無損監(jiān)控其代謝特征，對生物標志物（Biomarker）的發(fā)現(xiàn)和確認具有重要

2、意義。
　　本研究建立了基于LC-MS代謝組學技術(shù)的細胞氨基酸代謝足跡分析方法，并以肺癌和支氣管上皮細胞為生物模型，獲得其氨基酸代謝輪廓特征差異。研究首先基于高分辨質(zhì)譜技術(shù)對肺癌細胞和非腫瘤對照細胞——支氣管上皮細胞的細胞外液進行非靶向代謝組學分析，通過檢測樣本中的小分子代謝物(相對分子量≤1000Da)，結(jié)合主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘法（OPLS-DA）和分層聚類分析（HCA）等化學計量學及模式識別手段，采用多標準評價

3、（VIP排序、Pearson相關(guān)常數(shù)及Jack-Knife置信區(qū)間等參數(shù)）對差異代謝物進行鑒定和解釋，結(jié)果提示肺癌細胞和對照細胞的脂代謝和氨基酸/多肽代謝產(chǎn)物表現(xiàn)出明顯差異?；谡n題組分子細胞生物學前期研究結(jié)果并結(jié)合腫瘤氨基酸代謝相關(guān)文獻調(diào)研，我們采用靶向代謝組學手段對肺癌細胞和支氣管上皮細胞的細胞外液進行了氨基酸代謝足跡分析。為避免基質(zhì)中待測物干擾，實驗有針對性地開發(fā)并建立了氨基酸替代分析物法，將待測氨基酸對應的穩(wěn)定性同位素作為替代分

4、析物加入到正常的生物基質(zhì)中建立標準曲線，從而更加準確地定量檢測細胞培養(yǎng)液中的多種氨基酸；此外，方法采用親水作用色譜（HILIC），避免采用傳統(tǒng)氨基酸檢測方法中所需的衍生化試劑和離子對試劑，大大簡化了樣品前處理步驟，縮短了分析時間并提高了檢測靈敏度。方法學驗證結(jié)果表明此方法表現(xiàn)出較好的準確度（91.54％≤RE≤114.31%）、重復性（0.87%≤RSD≤14.48%）和較高的回收率（Recovery≥75.35%）。應用該方法對肺癌細