菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）酚氧化酶的分離純化及其部分生物化學(xué)性質(zhì)的研究.pdf

1、無脊椎動(dòng)物缺乏真正的抗體，僅具有先天性非特異性免疫系統(tǒng)，查清非特異性免疫物質(zhì)及細(xì)胞的非特異性免疫作用的機(jī)制，對提高無脊椎動(dòng)物的整體免疫功能是至關(guān)重要的。 酚氧化酶是無脊椎動(dòng)物非特異性免疫系統(tǒng)中的主要成員之一，在免疫防御中起著關(guān)鍵性作用。業(yè)已證明，酚氧化酶原激活系統(tǒng)在無脊椎動(dòng)物中起著重要的異物識別和防御功能。外來信號按一定順序最終激活了酚氧化酶原(prophcnoloxidase，proPO)而成為有活性的PO，活性PO誘導(dǎo)有關(guān)底

2、物由酚變成醌，最終產(chǎn)生黑色素，黑色素沉積到外來物上，通過包被和黑化將其隔離和殺死，以達(dá)到免疫的效果，而且黑色素及其代謝中間產(chǎn)物還可抑制病原菌胞外蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)酶的活性，從而殺死微生物和寄生蟲，起到免疫作用。弄清酚氧化酶(ECl.10.3.1)的生物化學(xué)性質(zhì)，進(jìn)而確定其在免疫防御中的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制，對于無脊椎動(dòng)物免疫學(xué)及其養(yǎng)殖業(yè)均具有重要意義。 本文以菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)的血淋巴為材

3、料，利用硫酸銨沉淀、離子交換柱層析和凝膠過濾柱層析等方法，對PO進(jìn)行了分離純化并以L-二羥苯丙氨酸(L-DOPA)為特異性底物對其生物化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，proPO的分子量為84.1 kDa左右，在實(shí)驗(yàn)操作過程中極易發(fā)生降解或自身降解，變成有活性的大小約76.9 kDa的PO，1％SDS即可使該proPO全部被激活而成為有活性的PO。通過純化發(fā)現(xiàn)2 kg菲律賓蛤仔可以得到0.021 mg PO，純化的PO特異性活性提高了62.5

4、倍，得率為48％。該P(yáng)O對L-二羥苯丙氨酸(L-DOPA)發(fā)生特異性反應(yīng)的最適pH值為7.0、最適溫度為40℃、K<,m>值約為2.2 mmol/L，而對酪氨酸的K<,m>值則為6.0 mmol/L，說明PO對L-DOPA具有更高的親和力。多種氧化酶特異性抑制劑對PO純化樣品酶活性的影響結(jié)果表明，苯甲酸(benzoic acid)和亞硫酸鈉(sodium sulfite)對PO活性具有極強(qiáng)的抑制作用，檸檬酸(citric acid)、苯

5、硫脲(1-phenyl-2-thiourca)、硫脲(thio urea)和半胱氨酸(cysteine)對PO活性也具有很強(qiáng)的抑制作用，而抗壞血酸(ascorbic acid)對PO的抑制作用不顯著。結(jié)合該P(yáng)O對酪氨酸等單酚也具有高度特異性的氧化活性，從而證明它是一種酪氨酸酶型的酚氧化酶。此外，該酶對EDTA、DETC和金屬離子非常敏感，其活性能被EDTA、DETC和Cu<'2+>等強(qiáng)烈抑制，且10mmol/L Cu<'2+>能完全回復(fù)