菲律賓蛤仔酶解寡肽抗氧化活性研究.pdf

1、氧化反應(yīng)在許多生物體中是一種重要的生物進(jìn)程,自由基作為氧化反應(yīng)的產(chǎn)物,非常不穩(wěn)定,可能導(dǎo)致DNA或蛋白質(zhì)損傷,進(jìn)而引發(fā)多種疾病,包括癌癥,阿爾茲海默氏癥以及其他神經(jīng)性疾病。盡管合成的抗氧化物具有良好的抗氧化活性,但因其潛在的毒性和副作用,消費(fèi)者對(duì)這些抗氧化物的抵抗越來越強(qiáng),因此,從自然資源中開發(fā)抗氧化物成為新的研究熱點(diǎn)。
　　本實(shí)驗(yàn)采用酶解法制備菲律賓蛤仔酶解肽,酶解工藝通過正交試驗(yàn)方案進(jìn)行優(yōu)化,以最佳酶解條件制備酶解粗提物,粗提

2、物經(jīng)過分離純化,氨基酸序列分析,結(jié)構(gòu)表征分析等得到酶解寡肽純化物;從體外和小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)兩方面對(duì)菲律賓蛤仔酶解寡肽的抗氧化活性進(jìn)行研究。具體有如下幾個(gè)部分。
　　第一部分,菲律賓蛤仔酶解寡肽的制備。
　　首先將菲律賓蛤仔肌肉組織勻漿,利用胰蛋白酶酶解,采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),以DPPH清除力為指標(biāo),對(duì)活性肽的酶解制備工藝進(jìn)行優(yōu)化,得出最佳酶解條件為物料比1:2,加酶量2000U/g,pH為8,酶解溫度為40℃,酶解時(shí)間12h。在此酶

3、解條件下制備酶解物,利用超濾法將酶解物按分子量大小分成四個(gè)組分,收集抗氧化活性最強(qiáng)組分,濃縮后冷凍干燥,干燥物經(jīng)G-25凝膠分離得到六個(gè)洗脫峰,收集抗氧化活性最高的峰,濃縮、冷凍干燥后經(jīng)反相高效液相梯度洗脫進(jìn)一步分離得到三個(gè)洗脫峰,選取最強(qiáng)抗氧化活性組分收集,高效液相檢測(cè)得出該提取物為單一組分,氨基酸序列分析得其序列為Gly-Asp-Gln-Gln-Lys,分子量為575.45Da。
　　第二部分,體外研究菲律賓蛤仔酶解寡肽抗氧化

4、活性。
　　1、采用分光光度法測(cè)定寡肽對(duì)2,2′-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)自由基、超氧陰離子(O2-·)、羥自由基(·OH)、DPPH自由基的清除能力,還原力和寡肽的金屬離子螯合能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)菲律賓蛤仔酶解寡肽具有較顯著的ABTS自由基(半數(shù)有效濃度(EC50)0.204 g.L-1)、羥自由基(EC500.815 g.L-1)、超氧陰離子自由基(EC500.066 g.L-1)清除能力、

5、還原力和金屬離子螯合能力(EC501.554 g.L-1)。
　　2、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)寡肽對(duì)羥自由基誘導(dǎo)的DNA損傷的保護(hù)作用。結(jié)果顯示,與空白組(Blank)相比,對(duì)照組(Control)中超螺旋結(jié)構(gòu)的DNA幾乎完全消失并轉(zhuǎn)化為開環(huán)結(jié)構(gòu),而加樣組(1.25 mg/mL,2.5 mg/mL和5 mg/mL)大部分DNA仍以超螺旋結(jié)構(gòu)存在,小部分DNA被損傷形成開環(huán)結(jié)構(gòu)DNA。說明寡肽對(duì)羥自由基誘導(dǎo)的DNA損傷顯示出有效地保護(hù)作用

6、,并且保護(hù)作用隨濃度的升高而增強(qiáng)。
　　3、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)寡肽對(duì)腫瘤細(xì)胞DU-145和人體正常前列腺細(xì)胞RWPE-1的增殖抑制效應(yīng),結(jié)果發(fā)現(xiàn),寡肽對(duì)前列腺癌DU-145細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用(IC505.202mg/mL),并呈良好的量效關(guān)系。且人體正常前列腺細(xì)胞RWPE-1細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果表明,寡肽對(duì)RWPE-1細(xì)胞無增殖抑制作用。
　　第三部分,菲律賓蛤仔酶解寡肽體內(nèi)抗氧化活性研究。
　　ICR

7、雄性小鼠隨機(jī)分成四組,分別灌服高、中、低劑量寡肽和生理鹽水。連續(xù)給藥30d后,心臟采血及組織取樣,用試劑盒測(cè)定小鼠血清、腦、肝臟組織中超氧化歧化酶(superoxidedismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathioneperoxidase,GSH-Px)活力和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量。結(jié)果顯示,菲律賓蛤仔酶解寡肽可有效提高小鼠體內(nèi)SOD和GSH-Px活力,并降低MDA含量,表明寡肽具有小