雞傷寒沙門菌1009ΔspiCΔcrp減毒株的構(gòu)建及其安全性和免疫效力研究.pdf

1、堡量墮魚塞鯊!!墮壅童鱉!壘旦!壘翌鱉壘絲塑塑堡壁基窶全絲塑魚鑒鏊查堡絲!雞傷寒沙門菌1009AspiCAcrp減毒株的構(gòu)建及其安全性和免疫效力的評(píng)價(jià)研究生：程瞿導(dǎo)師：潘志明教授焦新安教授中文摘要禽傷寒(fowltyphoid)是因感染雞傷寒沙門菌(SalmonellaGallinarum)而導(dǎo)致的急性或慢性敗血性禽類傳染病，表現(xiàn)出腹瀉、厭食、精神不振等癥狀，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病可通過藥物進(jìn)行治療，雖然減少了死亡，但長期用藥

2、會(huì)增加成本，易產(chǎn)生耐藥性，且愈后帶菌，因此，免疫接種仍是預(yù)防和控制該病的一個(gè)理想選擇。最先被用于控制禽傷寒的減毒活疫苗9R，能有效的抵抗雞傷寒沙門菌的感染，但其殘留的毒力仍有致病性。因此，研制一種安全有效的雞傷寒沙門菌減毒疫苗仍將十分必要。本研究利用自殺質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組技術(shù)構(gòu)建出雞傷寒沙門菌1009株的spiC基因缺失株1009AspiC，在此基礎(chǔ)上，運(yùn)用九噬菌體同源重組系統(tǒng)進(jìn)一步敲除crp基因，構(gòu)建出雞傷寒沙門菌1009AspiCA

3、crp雙基因缺失株。PCR和測序鑒定結(jié)果表明，成功獲得雞傷寒沙門菌雙基因缺失株1009AspiCAcrp。生物學(xué)特性研究結(jié)果顯示，1009株spiC和crp基因的缺失能夠得到穩(wěn)定的遺傳，缺失株部分生化特性發(fā)生了變化，生長速度減慢，與野生株相比其對(duì)雛雞的LD50升高了107倍，表明雙基因的缺失使雞傷寒沙門菌1009AspiCAcrp毒力減弱。為評(píng)價(jià)1009AspiCAcrp減毒株的安全性及保護(hù)效力，本實(shí)驗(yàn)采用肌肉注射的方式分別以1105C

4、FU、1106CFU、1x107CFU的劑量對(duì)3日齡雛雞進(jìn)行初次免疫并于1周后再次免疫，同時(shí)對(duì)照組用PBS以相同方式進(jìn)行免疫。體重測定以及臨床觀察結(jié)果顯示其與對(duì)照組沒有差別，表明減毒株對(duì)雛雞的生長沒有影響且不會(huì)出現(xiàn)副作用，細(xì)菌在肝臟和脾臟中短暫定殖后可被機(jī)體清除。血清IgG抗體水平和淋巴細(xì)胞增殖的檢測結(jié)果表明，肌肉注射免疫后減毒株誘導(dǎo)雛雞產(chǎn)生了良好的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答。免疫后21天，攻毒保護(hù)效力結(jié)果顯示免疫組在攻毒后沒有出現(xiàn)臨床癥狀

5、，免疫保護(hù)率為100％。另外，本研究以1009AspiCAcrp減毒株口服免疫雛雞后，對(duì)減毒株的安全性和免疫效力進(jìn)行了初步研究。在對(duì)3日齡雛雞進(jìn)行口服免疫并于1周后進(jìn)行再次免疫后，免疫組雛雞體重增長與對(duì)照沒有顯著差異；產(chǎn)生了較高的IgG抗體水平，并于初次免疫3周后達(dá)到最高且顯著高于對(duì)照組；IL4、IL6幣DIL113的表達(dá)水平也出現(xiàn)上調(diào)。在初次免疫后21天用TheDevelopmentofAttenuatedSalmonellaGall

6、inarum1009AspiCAcrpasanEcientLiveVaccineCandidateMScandidate：ChengZhaoAdvisors：ProfZhimingPanProfXinanJiaoAbstractAtpresent，fowltyphoid(FT)isaseverebacterialinfectiousdiseaseItwascausedbySalmonellaGallinarum(SGallinarum)

7、andresultsinsubstantialeconomiclossesinmanyareaswithsevereanorexia，weightloss，lesions，depression，diarrheainchickensLivevaccinesCanoffermoreeffectiveprotectionthankilledvaccinesbecauseoftheirinductionofhighlycellularimmun

8、eresponsesCurrentlythelive＆Gallinarumvaccinestrain9Rhasbeenavialable，butithassomedisadvantages，suchasresidualvirulence，lowgrowthrateandinsufficientprotectionInthisstudy，aAspiCmutantofSalmonellaGallinarumstrain1009wascons

9、tructedbytheallelicexchangeintroducedbythetransformatinofarecombinantsuicideplasmid，thecrpgeneWasthendeletedbyusingthe九Redbasedrecombinationsystem，togiverisetoadoublemutant1009AspiCAcrpwhichWasconfirmedbyPCRandsequencean

10、alysisAnalysisofthebiologicalcharacteristicsofthemutantshowedthatthestrainwasstablewithbothgenesdeletedHowever，itsbiochemicalpropertieswerealittledifferentfromthoseoftheparentstrain，andthegrowthvelocityofthe1009AspicAcrp

11、Wasslowerthanthe1009strainThechickenlethaltestshowedthattheLDs0ofthe1009AspicAcrpstrainwas107timeshigherthanthatof1009，implyingthedownregulationofthemutantInordertoevaluatedthesafetyandprotectiveefficacyofthemutant1009As

12、piCAcrp，three—dayoldchickenswereintramuscularlyimmunizedwith1009AspiCAcrpforthefirsttimeandweresubsequentlyboostedat7dayslaterwiththesamedosesandroute(vaccinatedgroup)，whilethecontrolgroupwasimmunizedwithPBS(controlgroup

13、)Specifichumoralandcellularimmuneresponsesweresignificantlyinducedand1009AspiCAcrpCancolonizeandpersistentinliverandspleenofchickensmorethan14daysafterimmunizationVaccinatedgroupshowednodifferencesinbodyweightorclinicals