鼠傷寒沙門氏菌ΔcrpΔasd缺失株及其ND-HN重組菌株的構(gòu)建.pdf

1、鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium，St)是一種非常重要的人畜共患病原菌，它是一種胞內(nèi)侵襲性細(xì)菌并對(duì)黏膜有很強(qiáng)的嗜性。通過(guò)各種方法減毒的鼠傷寒沙門菌對(duì)宿主的致病性顯著降低，但仍保留良好的侵襲力，不但可作為減毒疫苗，也可作為外源抗原的有效載體。目前，利用減毒鼠傷寒沙門菌作為裁體傳遞外源抗原基因疫苗已成為目前基因免疫研究的熱點(diǎn)之一。
　　減毒鼠傷寒沙門菌SL1344Δcrp由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，它是利用重組自殺性質(zhì)粒

2、介導(dǎo)的細(xì)菌等位基因交換技術(shù)構(gòu)建而成，不含任何抗性基因。本室已對(duì)其生長(zhǎng)特性、耐藥性、遺傳穩(wěn)定性及毒力等作出了評(píng)價(jià)，研究結(jié)果表明，該減毒株具有良好的穩(wěn)定性和安全性；asd基因是鼠傷寒沙門菌的營(yíng)養(yǎng)缺陷型基因，缺失后會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌不能正常合成細(xì)胞壁而裂解死亡。如果將含有asd基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入asd-缺失菌株中構(gòu)成宿主-載體平衡致死系統(tǒng)，該菌則可恢復(fù)正常的生長(zhǎng)能力。基于上述條件，為研制更加安全有效的減毒鼠傷寒沙門菌疫苗，并將其開(kāi)發(fā)為新型活疫苗載體，本研

3、究在SL1344Δcrp的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步缺失asd基因，構(gòu)建鼠傷寒沙門菌SL1344ΔcrpΔasd雙基因缺失突變株，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，進(jìn)一步地應(yīng)用該缺失株攜帶雞新城疫（Newcastle disease，ND）的HN基因，為開(kāi)發(fā)以減毒鼠傷寒沙門菌為載體的口服基因工程疫苗奠定了基礎(chǔ)。
　　1.鼠傷寒沙門菌SL1344ΔcrpΔasd缺失株的構(gòu)建及篩選
　　以χ7213(pREΔasd)為供體菌，鼠傷寒沙門菌 SL13

4、44Δcrp為受體菌，利用重組自殺性質(zhì)粒介導(dǎo)細(xì)菌基因等位交換技術(shù)兩步法篩選 SL1344ΔcrpΔasd雙缺失突變株，并通過(guò)PCR及測(cè)序進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明該雙缺失株構(gòu)建成功。
　　2.缺失株SL1344ΔcrpΔasd的生物學(xué)特性研究
　　該缺失株SL1344ΔcrpΔasd需要在DAP存在下才能生存，在對(duì)該菌進(jìn)行各項(xiàng)生物學(xué)特性研究中，均加入了 DAP。研究發(fā)現(xiàn)，該雙缺失株的表型性狀與強(qiáng)毒株相比發(fā)生了明顯變化，SL1344Δ

5、crpΔasd失去了利用麥芽糖、丙三醇、山梨醇等的能力，也不能分解 H2S，但仍保留了利用葡萄糖、半乳糖等的能力，這些都與親本菌株 SL1344Δcrp保持一致；雙缺失株 SL1344ΔcrpΔasd與親本株 SL1344Δcrp生長(zhǎng)速度都明顯慢于強(qiáng)毒株 SL1344，而雙缺失株 SL1344ΔcrpΔasd由于補(bǔ)充有外源 DAP，其生長(zhǎng)速度與親本株 SL1344Δcrp相差不大；雙缺失株的血清型沒(méi)有發(fā)生改變，且能穩(wěn)定遺傳缺失后的asd

6、基因；其毒力較野毒株SL1344降低了約105倍。
　　3.重組減毒鼠傷寒沙門菌NDV-HN菌株的構(gòu)建與鑒定
　　以pMD18-T-HN為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增出雞新城疫HN基因片段，定向插入原核表達(dá)載體pYA3493中，將重組表達(dá)質(zhì)粒pYA3493-HN轉(zhuǎn)入減毒鼠傷寒沙門菌SL1344ΔcrpΔasd，通過(guò)雙酶切和PCR對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明攜帶雞新城疫HN基因片段的重組減毒鼠傷寒沙門菌SL1344ΔcrpΔasd（pYA