腸炎沙門氏菌SEF14菌毛基因缺失突變株的構(gòu)建及其相關(guān)功能分析.pdf

1、腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis,SE)是一類泛嗜性沙門氏菌，它不僅能引起肉雞和蛋雞的發(fā)病，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，而且是引起人類食物中毒的主要病原菌之一，在獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要意義。菌毛結(jié)構(gòu)在細(xì)菌致病過(guò)程中有著很重要的作用，研究表明菌毛結(jié)構(gòu)與感染早期對(duì)宿主特定靶組織的定植和黏附有關(guān)，同時(shí)，它也能作為一種針對(duì)上皮細(xì)胞表面病原菌的潛在免疫原。腸炎沙門氏菌能表達(dá)多種菌毛結(jié)構(gòu)，其中SEF14菌毛是90年代分離出來(lái)的，

2、僅在腸炎沙門氏菌和都柏林沙門氏菌中表達(dá)。目前，關(guān)于SEF14菌毛的功能仍在探討之中。
　　 為了研究SEF14菌毛的功能及其在腸炎沙門氏菌致病過(guò)程中的作用，本試驗(yàn)利用高效自殺性載體系統(tǒng)和Red同源重組系統(tǒng)對(duì)3種不同來(lái)源腸炎沙門氏菌(包括國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)株50336、禽源分離株S.09以及人源分離株43)SEF14菌毛操縱子亞單位sefA和sefD編碼基因進(jìn)行敲除，并對(duì)這兩種系統(tǒng)進(jìn)行比較。本試驗(yàn)成功構(gòu)建了腸炎沙門氏菌國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)株50336、

3、禽源分離株S.09以及人源分離株43的sefA和sefD基因缺失株各3株，并在△sefA缺失株的基礎(chǔ)上又運(yùn)用Red同源重組系統(tǒng)再次進(jìn)行了sefD基因的缺失突變，構(gòu)建了雙缺失突變株△sefA△sefD各3株。高效自殺性載體系統(tǒng)需要構(gòu)建含同源DNA片段的重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化宿主菌，其一次重組效率高；二次重組只需用含5％蔗糖的平板傳代即可進(jìn)行抗性質(zhì)粒丟失，且在染色體上不留任何痕跡，但重組效率低。而Red同源重組系統(tǒng)能將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物一步法直接轉(zhuǎn)化入

4、腸炎沙門氏菌，通過(guò)同源臂發(fā)生同源重組交換缺失sefD基因。由于對(duì)PCR產(chǎn)物和感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)量要求很高，故一次重組率低，而二次重組則相對(duì)簡(jiǎn)單高效，最后在染色體上殘留FRT位點(diǎn)。雖然兩個(gè)系統(tǒng)都能對(duì)腸炎沙門氏菌染色體進(jìn)行直接修飾，且都無(wú)抗性選擇標(biāo)志的殘留，但實(shí)際操作中，Red同源重組系統(tǒng)較傳統(tǒng)的高效自殺性載體系統(tǒng)更簡(jiǎn)便而高效。
　　 基于上述構(gòu)建的SEF14菌毛缺失突變株，比較并分析3株野生株和其對(duì)應(yīng)突變株△sefA、△sefD及△s

5、efA△sefD與腸上皮細(xì)胞IPEC-J2的黏附試驗(yàn)，以及小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)和在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活試驗(yàn)。結(jié)果表明：所有野生株及其相應(yīng)突變株在試驗(yàn)4h內(nèi)均能很好的與腸上皮細(xì)胞黏附，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)其黏附數(shù)量不斷增多，但野生株與其相應(yīng)突變株在黏附數(shù)量上的差異不顯著，因而推測(cè)在體外試驗(yàn)中SEF14菌毛可能并不介導(dǎo)腸炎沙門氏菌與小腸上皮細(xì)胞的黏附。而在與小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作用的4h內(nèi)時(shí)，活化的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)相應(yīng)突變株△sef4、△sefD