鼠傷寒沙門菌ΔsodA缺失株的構(gòu)建及其對(duì)巨噬細(xì)胞自噬的影響.pdf

1、鼠傷寒沙門菌作為病原菌，在入侵宿主體內(nèi)之后會(huì)遭遇到宿主出于免疫保護(hù)而形成的高活性氧（ROS）內(nèi)環(huán)境。過(guò)量的ROS會(huì)對(duì)生物體的DNA、蛋白質(zhì)和脂類等產(chǎn)生毒害作用。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)作為唯一可以清除超氧陰離子（?O2-）的抗氧化酶系成員，是細(xì)胞抵御ROS脅迫的第一道防線。已有研究表明，SOD參與到細(xì)菌的生長(zhǎng)、菌膜生成、毒力等方面，但是對(duì)于其在鼠傷寒沙門菌中的功能研究，迄今為止還未見(jiàn)報(bào)道。因此本

2、實(shí)驗(yàn)通過(guò)Red重組系統(tǒng)，構(gòu)建了鼠傷寒沙門菌SM52ΔsodA缺失株和SM52CΔsodA互補(bǔ)株，對(duì)其生物學(xué)特性以及對(duì)巨噬細(xì)胞自噬的影響進(jìn)行探討，并且表達(dá)了SodA蛋白，對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。為進(jìn)一步研究sodA基因的功能以及在細(xì)胞自噬過(guò)程中的作用奠定良好基礎(chǔ)。主要內(nèi)容如下：
　　1.鼠傷寒沙門菌ΔsodA缺失株的構(gòu)建及生物學(xué)特性研究
　　利用Red同源重組系統(tǒng)構(gòu)建鼠傷寒沙門菌sodA基因缺失株SM52ΔsodA以及互補(bǔ)株SM

3、52CΔsodA，并對(duì)其生長(zhǎng)速度、抗氧化脅迫、運(yùn)動(dòng)性、菌膜形成、耐環(huán)境壓力（酸、堿、滲透壓、血清）、ROS測(cè)定、酶活性等生物學(xué)特性進(jìn)行研究。結(jié)果顯示， SM52ΔsodA以及SM52CΔsodA構(gòu)建成功。SM52ΔsodA缺失株在生長(zhǎng)速度、抗氧脅迫、SOD酶活性、菌膜形成、耐血清方面相較于SM52、SM52CΔsodA下降明顯；SM52ΔsodA在流動(dòng)性、耐酸、耐堿、耐高滲透壓方面無(wú)變化； SM52ΔsodA胞內(nèi)外ROS含量顯著高于SM

4、52與SM52CΔsodA。
　　2.鼠傷寒沙門菌超氧化物歧化酶sodA基因的表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究
　　利用原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建了pET-28a-sodA表達(dá)載體，經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)。過(guò)鎳柱將SodA蛋白純化之后對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。結(jié)果顯示SodA蛋白分別在40℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)為0、PH=7.0時(shí)到達(dá)最大活性，隨著條件的變化，活性逐次降；其熱穩(wěn)定性較一般，80℃保溫1h，活性僅剩21％；抑制劑實(shí)驗(yàn)中，Sod

5、A蛋白對(duì)SDS、氯仿-乙醇敏感，對(duì)H2O2不敏感；Mn2+、Zn2+、Cu2+對(duì)SodA蛋白活性促進(jìn)效果最明顯， Fe3+抑制效果最明顯， Mg2+、Ca2+、Ba2+、Na+、K+對(duì)蛋白活性無(wú)影響；SodA蛋白催化鄰苯三酚的Vmax為2.03 U/min，Km為0.801 mmol/L。
　　3.鼠傷寒沙門菌sodA基因?qū)奘杉?xì)胞自噬的影響
　　將SM52、SM52ΔsodA、SM52CΔsodA感染鼠巨噬細(xì)胞RAW264

6、.7后，應(yīng)用熒光共聚焦觀察 LC3-Ⅱ變化；以及蛋白免疫印跡(Western blot，WB)法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)自噬相關(guān)蛋白 LC3-Ⅱ、Beclin-1、p62含量的變化；觀察不同時(shí)間點(diǎn)胞內(nèi)活菌數(shù)量變化。熒光共聚焦結(jié)果顯示，在細(xì)胞與細(xì)菌共培養(yǎng)1 h后， SM52ΔsodA感染組胞內(nèi) LC3-Ⅱ的點(diǎn)狀聚集數(shù)量明顯高于 SM52、SM52CΔsodA組（P＜0.05）；WB結(jié)果顯示，在細(xì)胞與細(xì)菌共培養(yǎng)1 h后，SM52ΔsodA感染組的LC

7、3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)量都比 SM52、SM52CΔsodA組明顯上升（P＜0.05），p62蛋白表達(dá)量下調(diào)明顯，共培養(yǎng)2 h和3 h之后沒(méi)有明顯變化?；罹?jì)數(shù) CFU結(jié)果顯示，在共培養(yǎng)1 h之后，三組活菌數(shù)量無(wú)明顯差異，隨著時(shí)間延長(zhǎng)到2 h和3 h后，SM52、SM52CΔsodA感染組胞內(nèi)活菌數(shù)明顯高于SM52ΔsodA感染組（P＜0.05）。以上結(jié)果顯示 sodA對(duì)發(fā)生在細(xì)菌細(xì)胞共作用早期的自噬有抑制作用，利于攜帶sod