鼠傷寒沙門氏菌適配體的篩選及應(yīng)用研究.pdf

1、沙門氏菌病是公共衛(wèi)生學上最有重要意義的的人畜共患病之一，其病原沙門氏菌屬于腸桿菌科，是一大群寄生于人類和動物腸道內(nèi)，抗原構(gòu)造和生化反應(yīng)相類似的革蘭氏陰性桿菌的統(tǒng)稱。尤其以鼠傷寒沙門氏菌為代表的病原菌在食品安全、環(huán)境監(jiān)測、疾病預防等方面造成了巨大的威脅，對人體健康造成了很大危害。如何實現(xiàn)沙門氏菌的快速檢測成為當前研究的熱點問題。
　　適配體是通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術(shù)(SELEX)篩選得到的一段短的單鏈DNA或RNA序列，它能夠

2、與相應(yīng)的靶標分子如金屬離子、有機小分子藥物、蛋白質(zhì)乃至整個細胞進行高親和力和強特異性的結(jié)合。由于適配體幾乎可與每一個目標分子進行化學修飾，在生物分子的分析檢測和治療診斷等方面開創(chuàng)了一個新的局面。
　　石墨烯是一種由純碳原子緊密堆積成單層蜂窩網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的新型二維納米材料。由于具有非常大的比表面積、優(yōu)良的導熱性和導電性、使得石墨烯在諸多領(lǐng)域都得到了廣泛應(yīng)用。氧化石墨烯是石墨烯的一種重要衍生物，表面大量存在的含氧基團能夠增加其親和性及水溶

3、性。近年來，通過利用氧化石墨烯良好的生物相容性、高的熒光猝滅效率以及大的比表面積等優(yōu)點，相繼開發(fā)了各種熒光生物傳感器。
　　本論文以鼠傷寒沙門氏菌特異性識別、靈敏檢測這一熱點問題為切入點，主要開展了以下兩個方面的研究工作:
　　一、SELEX篩選鼠傷寒沙門氏菌適配體方法的建立及適配體克隆、測序、鑒定及分析
　　以鼠傷寒沙門氏菌（S.typhimurium）為靶標，利用體外細胞SELEX篩選技術(shù)，構(gòu)建了全長為78個堿基，

4、中間含35個堿基隨機序列的單鏈核苷酸文庫，通過11輪反復常規(guī)篩選以及以腸炎、豬霍亂、甲型副傷寒和亞利桑那沙門氏菌為靶標的4輪消減篩選，初步篩選到一組能特異性結(jié)合S.typhimurium的核酸適配體群。對最后一輪篩選得到的核酸適配體的PCR產(chǎn)物進行克隆測序，獲得了39條適配體序列。隨后對它們進行一級結(jié)構(gòu)的同源性分析及二級結(jié)構(gòu)的模擬分析，最終獲得了6條對S.typhimurium親和力高、特異性好的序列。利用熒光分析法對其親和力進行測定，

5、Kd值均為0～100nM，其中Apt6的親和力最高，Kd值僅為30±4nM。隨后通過選擇特異性實驗分析表明，適配體與S.typhimurium的結(jié)合具有很強的特異性且對同種屬的沙門氏菌不會有交叉結(jié)合。
　　二、構(gòu)建基于納米材料氧化石墨烯的熒光適配體傳感器
　　利用氧化石墨烯熒光猝滅劑的性質(zhì)和高特異性適配體，構(gòu)建了快速、簡單、高靈敏的熒光適配體傳感器。在沒有靶標S.typhimurium時，熒光標記的適配體會自動吸附到氧化石墨