核酸適配體對沙門氏菌的檢測及其菌膜的控制.pdf

1、沙門氏菌是一類常見的人畜共患致病菌，由家禽、鳥畜等傳染給人類，易引起胃腸炎、敗血癥、傷寒等感染性疾病，給人類和動物健康造成巨大威脅。其中，以甲型副傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌較為常見。由沙門氏菌形成的細(xì)菌菌膜在宿主體內(nèi)以及自然環(huán)境當(dāng)中廣泛存在，造成疾病難以治愈和反復(fù)發(fā)作。由甲型副傷寒沙門氏菌可引起的疾病仍在全球范圍內(nèi)持續(xù)發(fā)生，并越來越引起人類的關(guān)注，因此對甲型副傷寒沙門氏菌的實時快速檢測已成為必要。豬霍亂沙

2、門氏菌以侵害4個月以下的斷奶仔豬為主，誘發(fā)仔豬腸道疾病，給養(yǎng)殖業(yè)造成直接經(jīng)濟(jì)損失。加之其菌膜的形成加劇了菌膜細(xì)菌的耐藥性，因此發(fā)展新方案用于豬霍亂沙門氏菌及其菌膜的控制已迫在眉睫。
　　(1)甲型副傷寒沙門氏菌的高靈敏性循環(huán)信號放大檢測。本實驗以熒光疊加、熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)以及限制性核酸內(nèi)切酶酶解作用為基本原理，構(gòu)建了一種簡單、低成本的DNA適配體傳感器用于甲型副傷寒沙門氏菌的熒光檢測。該傳感器由一條經(jīng)過延伸的適配體序列

3、、兩條末端修飾上FAM的短序列（探針1和探針2）構(gòu)成。當(dāng)靶標(biāo)不存在時，由于適配體傳感器與靶標(biāo)的特異性結(jié)合，修飾上FAM的適配體傳感器被吸附到氧化石墨烯上，F(xiàn)AM熒光被淬滅;當(dāng)靶標(biāo)存在時，修飾上FAM的適配體傳感器從氧化石墨烯表面釋放出來，從而檢測到FAM熒光信號。重要的是，熒光信號可以通過核酸內(nèi)切酶Ⅰ介導(dǎo)的靶標(biāo)循環(huán)放大。在最優(yōu)條件下，靶標(biāo)濃度在1×102到1×1011cells/mL范圍內(nèi)，熒光強度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，且最低檢測下限為1

4、×102 cells/mL。因此，證明該種檢測平臺對致病菌的檢測提供了一種高靈敏性和高特異性的檢測方法，并為其他細(xì)菌的檢測提供了可能性。
　　(2)核酸適配體-氨芐青霉素共軛物對豬霍亂沙門氏菌菌膜的控制。本實驗以豬霍亂沙門氏菌茵膜為研究對象，以適配體和氨芐青霉素的分子結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，以酰胺反應(yīng)為連接原理，探索了一種能通過協(xié)同作用控制菌膜的新方法。在靶細(xì)菌鞭毛蛋白適配體(aptamer3)的3'-末端上修飾氨基，通過酰胺反應(yīng)使之與氨芐青

5、霉素上的羧基共軛以形成多功能共軛物(Apt-Amp共軛物)。光譜研究確定了共軛物的正確合成，熒光分光光度法證明共軛物保留了適配體的特異性。倒置顯微鏡和原子力顯微鏡(AFM)顯微鏡觀察結(jié)果表明，共軛物對菌膜具有良好的控制作用。共軛物菌膜抑制效果為71.64％，菌膜消減效果為60.00％，而且效果均優(yōu)于組分（適配體、抗生素），推測共軛物以協(xié)同作用方式作用于菌膜。初步推測其作用機理是利用適配體對豬霍亂沙門氏菌鞭毛蛋白的特異性識別作用附著在菌膜