樂卡地平與貝那普利體內(nèi)外相互作用研究.pdf

1、目的:1.建立靈敏度高、專屬性強、方便可行的LC-MS/MS分析方法,同時測定血漿中樂卡地平、貝那普利和貝那普利拉的濃度。2.大鼠長期灌服樂卡地平與貝那普利,研究兩藥在大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)的相互影響。3.大鼠長期灌服樂卡地平與貝那普利,研究樂卡地平對貝那普利與貝那普利拉在大鼠尿和糞便中排泄的影響。4.體外考察貝那普利對肝微粒體中樂卡地平代謝的影響。
　　方法:1.本實驗采用LC-MS/MS法。血漿樣品采用固相萃取的方法進(jìn)行提取,萃取

2、劑為甲醇。選用的內(nèi)標(biāo)為地西泮。色譜柱為Diamond C18(2)(150×4.6 mm,5μm);流動相:0.1%乙酸:乙腈(50:50);采用速度梯度,流速:0.6 mL/min(0-5 min);5-5.1min,1 mL/min:1 mL/min(5.1-7.5 min);7.5-7.6 min,0.6 mL/min:0.6 mL/min(7.6-8.5min)。柱溫:30℃;進(jìn)樣量:5μL。采用ESI離子源,正離子模式,干燥氣

3、(N2)流速9.0 L/min,干燥氣壓力40 psi,干燥氣溫度為350℃,毛細(xì)管電壓4000 V,多級反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式,612.3→280.2(樂卡地平),425.2→351.2(貝那普利),397.2→351.2(貝那普利拉),285.1→193.1(地西泮),EMV為400 eV。碎片電壓分別為120 V,90V,90 V和130 V,碰撞能分別為20 eV,25 eV,20 eV和34 eV。
　　2.分別考察大鼠

4、體內(nèi)樂卡地平對貝那普利及貝那普利對樂卡地平藥代動力學(xué)的影響。(1)貝那普利對樂卡地平藥代動力學(xué)的影響:24只健康Wistar大鼠隨機分為4組,各組給藥方法分別如下,樂卡地平組:樂卡地平(5 mg/kg),qd;貝那普利低劑量組:樂卡地平(5 mg/kg)+貝那普利(5 mg/kg),qd:貝那普利中劑量組:樂卡地平(5 mg/kg)+貝那普利(10 mg/kg),qd;貝那普利高劑量組:樂卡地平(5 mg/kg)+貝那普利(20mg/k

5、g),qd。連續(xù)給藥7天。第7天給藥后,分別于給藥前及給藥后0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24 h頸靜脈竇取血0.5 mL,采用已建立的血漿樣本處理方法和LC-MS/MS法分析血漿中樂卡地平濃度,采用DAS2.0計算藥代動力學(xué)參數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　(2)樂卡地平對貝那普利藥代動力學(xué)的影響:24只健康雄性Wistar大鼠隨機分為4組,各組給藥方法分別如下,貝那普利組:貝那普利(10 mg/kg)

6、,qd;樂卡地平低劑量組:貝那普利(10 mg/kg)+樂卡地平(2.5 mg/kg),qd,樂卡地平中劑量組:貝那普利(10 mg/kg)+樂卡地平(5 mg/kg),qd;樂卡地平高劑量組:貝那普利(10 mg/kg)+樂卡地平(10 mg/kg),qd。連續(xù)給藥7天。第7天給藥后,分別給藥前及給藥后0.083、0.16、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24 h頸靜脈竇取血0.5 mL,采用已建立的血漿

7、樣本處理方法和LC-MS/MS法分析血漿中貝那普利和貝那普利拉濃度,采用DAS2.0計算藥代動力學(xué)參數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　3.建立測定大鼠尿液及糞便中貝那普利和貝那普利拉濃度的LC-MS/MS法。健康wistar大鼠,按第二部分樂卡地平對貝那普利藥代動力學(xué)的影響實驗的給藥方法給藥后后,于實驗第6天,將大鼠置于代謝籠中,分別收集大鼠0-0.5,0.5-1,1-2,2-4,4-6,6-8,8-12,12-24 h的尿液和糞便,采用

8、已建立的尿液和糞便樣本處理方法和LC-MS/MS法分析尿液和糞便中貝那普利和貝那普利拉濃度,根據(jù)各時間段收集的尿液體積計算貝那普利與貝那普利拉的累積排泄量。
　　4.樂卡地平與貝那普利或酮康唑與0.5 mg/mL肝微粒體共同孵育30 min,終止反應(yīng)。采用LC-MS/MS法分析孵育液中樂卡地平含量的變化,考察貝那普利對肝微粒體CYP3A活性以及樂卡地平代謝的影響。
　　結(jié)果:1.樂卡地平、貝那普利與貝那普利拉的線性范圍均為1

9、～2000 ng/mL,最低定量限均為1 ng/mL。樂卡地平絕對回收率為71.94%～73.95%,基質(zhì)效應(yīng)為94.34%～97.19%;貝那普利絕對回收率為92.42%～92.81%,基質(zhì)效應(yīng)為95.78%～99.03%,貝那普利拉絕對回收率為91.90%～94.95%,基質(zhì)效應(yīng)為95.84%～100.98%;各物質(zhì)回收率與基質(zhì)效應(yīng)均無濃度依賴性,日內(nèi)日間RSD均小于15%。樂卡地平、貝那普利與貝那普利拉血漿樣品在長期冷凍(30天)

10、、反復(fù)凍融(兩次)以及提取后室溫條件下放置8 h后穩(wěn)定。
　　2.與樂卡地平單方給藥組相比,大鼠連續(xù)7日灌服樂卡地平與低、中、高(5、10、20mg/kg)貝那普利后,樂卡地平在大鼠體內(nèi)的藥量隨著聯(lián)合使用貝那普利的用藥量增加有增加的趨勢,但各給藥組間沒有統(tǒng)計學(xué)差異。體內(nèi)平均滯留時間隨著貝那普利的用藥量的增加而延長。樂卡地平峰濃度Cmax隨貝那普利的用藥量的增加而減小,其中10mg/kg和20 mg/kg貝那普利,可使樂卡地平Cma

11、x減小17.33%(p＜0.05)和12.34%(p＜0.05)。
　　與貝那普利單方給藥組相比,貝那普利聯(lián)合樂卡地平低、中、高劑量給藥后,貝那普利AUC依次遞增,其中AUC0-24h分別增加了3.42%,6.04%和9.63%(p＜0.05)。AUC0-∞分別增加了3.35%,6.69%和9.86%(p＜0.05)。其余參數(shù)均無明顯變化。貝那普利拉體內(nèi)藥量依次遞減,AUC0-24h分別減少了0.82%,4.11%,7.32%,A

12、UC0-∞分別減少了0.26%,3.64%,6.215%。各組間雖有下降的趨勢,但無統(tǒng)計學(xué)差異。高劑量樂卡地平(10 mg/kg)可引起貝那普利體內(nèi)藥量明顯增加,此劑量遠(yuǎn)高于臨床劑量。
　　3.大鼠長期灌胃給藥貝那普利,以及貝那普利聯(lián)合低、中、高劑量的樂卡地平,連續(xù)給藥七天后。各組的大鼠尿液中貝那普利24小時累積排泄量分別為281.510±52.407,310.057±65.610,305.272±63.328,287.742±4

13、8.986 ng。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)配對t-檢驗,各給藥組間貝那普利排泄量沒有顯著差異。各組貝那普利拉24小時累積排泄量分別為6289.125±1721.376,7144.304±2601.19,6010.824±1104.396,6066.845±992.641ng。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)配對t-檢驗,各給藥組間貝那普利拉排泄量沒有顯著差異。樂卡地平與貝那普利合用,不影響貝那普利和貝那普利拉在尿中的排泄,聯(lián)合用藥不會引起貝那普利和貝那普利拉在體內(nèi)的蓄積。

14、r>　　4.采用LC-MS/MS法測定肝微粒體孵育體系中樂卡地平濃度,樂卡地平在1～2000ng/mL范圍內(nèi)線型良好(R2＞0.99)。經(jīng)肝微粒體孵育顯示,酮康唑(1μmol/L)對樂卡地平(1600 ng/mL)代謝具有強的抑制作用(IC50＜1μmol/L),貝那普利(1,5,10,20,50μmol/L)對大鼠肝微粒體中樂卡地平(1600 ng/mL)的代謝沒有抑制作用(IC50＞50μmol/L)。
　　結(jié)論:大鼠長期灌服