馬耳他布氏菌弱毒疫苗M5-90外膜蛋白BP26和OMP31抗原表位及其疫苗免疫評價.pdf

1、背景:布魯氏菌在我國為乙類病原微生物，主要引起布魯氏菌病，簡稱布病，是目前世界上流行最廣、危害最大的人獸共患病之一。布病可引起動物的流產(chǎn)和不孕，引起人急性波狀熱等，容易轉(zhuǎn)入慢性引起肝脾、淋巴結(jié)腫大，關(guān)節(jié)炎等變態(tài)反應(yīng)性疾病。有部分病例表明布病可導(dǎo)致孕婦流產(chǎn)，甚至還出現(xiàn)母嬰垂直傳播。據(jù)統(tǒng)計資料表明，全世界每年約有50萬人感染布魯氏菌病，每年因該病造成的經(jīng)濟(jì)損失近30億美元，而中國處于人間布病發(fā)病率超過1/10萬的國家之一，為布病“重災(zāi)區(qū)”國

2、家，主要威脅寧夏、新疆、浙江、山西、甘肅、遼寧、上海、青海、河北、江蘇等約28省。據(jù)中國CDC報告，2005～2008年全國布病新發(fā)病人分別為18416、19013、21901、30002例，2006年、2007年發(fā)病數(shù)上升到全國甲類、乙類傳染病發(fā)病數(shù)順位的第10位。2009年（37734例）發(fā)病人數(shù)超過3.5萬，達(dá)歷史新高。但2012年最新CDC的統(tǒng)計報告顯示發(fā)病人數(shù)已接近4萬，至39875人，以平均每年10％的速率上升，赫然成為最嚴(yán)

3、重的公共衛(wèi)生問題之一。在人感染布菌中，80％以上是通過接觸感染羊及其產(chǎn)品導(dǎo)致的。因此，預(yù)防人的布病首要是預(yù)防羊布菌感染。
　　 布魯氏菌是一種能引起變態(tài)反應(yīng)的兼性胞內(nèi)寄生菌，主要寄生在一些專職和非專職吞噬細(xì)胞中，如巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞等。據(jù)不完全統(tǒng)計，世界上有近60種野生動物對布魯氏菌侵襲可產(chǎn)生各種血清學(xué)反應(yīng)，近30種野生動物身上寄生了各生物種的布魯氏菌。在我國流行的主要為羊、牛、和豬種，羊種(B.melitensis)占流行株8

4、0％，牛種(B.abortus)占10％，豬種(B.suis)不到1％。B.melitensis是綿羊和山羊的致病菌，也是對人毒力最強(qiáng)、危害最大的亞種。
　　 布魯氏菌病臨床癥狀復(fù)雜，引起的發(fā)熱、流產(chǎn)等病理損害易與某些常見疾病混淆;醫(yī)生很難單憑有無病畜接觸史來診斷布氏菌感染，給診斷帶來了一定的困難，容易導(dǎo)致誤診，造成慢性感染。另一方面缺乏有效的治療手段，抗生素的大量長期使用仍很難見效，且容易引起耐藥性問題。因此，布魯氏菌的疫苗預(yù)

5、防和早期快速診斷對布菌的防控具有重大的現(xiàn)實意義;其中疫苗的免疫效果和布菌診斷的準(zhǔn)確性就顯得尤為重要。
　　 預(yù)防布病的疫苗，必須能有效誘導(dǎo)以產(chǎn)生IFN-γ為特征的Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)，尤其是CTL介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)。羊種布菌疫苗M5-90是我國自主研發(fā)用于綿羊和山羊接種的減毒活疫苗，免疫效果相對較好。但是缺乏其在天然宿主羊免接種后，體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)水平及免疫保護(hù)效果的相關(guān)研究，并且M5-90疫苗株也存在兩個缺陷:一是免疫動物與自

6、然感染動物不能區(qū)別，嚴(yán)重影響了布病的診斷和檢疫;二是疫苗毒力較強(qiáng)，可引起部分孕畜流產(chǎn)。因此，研制一種新型的毒力低、免疫效果好、能進(jìn)行鑒別診斷的分子標(biāo)記疫苗勢在必行。
　　 目前，國內(nèi)外傾向于采用基因工程的手段對布菌現(xiàn)有疫苗進(jìn)行改造。國外曾有研究報道了羊種布菌疫苗株Rev.1 BP26基因缺失株(CGV26)并發(fā)現(xiàn)其仍具有免疫保護(hù)效果。但是，國內(nèi)研究人員對M5-90菌株進(jìn)行改造，敲除BP26得到新的突變株M5△bp26，其毒力有所

7、下降，但免疫應(yīng)答弱于原疫苗株，持續(xù)時間短，免疫效果達(dá)不到要求;相似的情況還出現(xiàn)在Rev.1的omp31缺失株中。由此推斷，BP26和OMP31蛋白可能與疫苗株毒力和保護(hù)性抗原相關(guān)，若將M5-90疫苗株攜帶的BP26基因全部敲除，則影響弱毒疫苗株的免疫效果。
　　 BP26蛋白是布菌的一種外膜間質(zhì)蛋白，在布菌多數(shù)亞種中具有高度的保守性。在感染的牛，綿羊，山羊和人中是一種免疫顯性優(yōu)勢抗原，可作為動物和人布病的診斷抗原，準(zhǔn)確率可達(dá)到8

8、6％以上。OMP31為膜孔蛋白，其基因序列在不同的種屬之間的同源性高達(dá)98％以上，在牛種菌中缺失，在羊種和豬種之間存在大約9個核苷酸的差異，并存在氨基酸序列的改變，故OMP31的單克隆抗體可能能夠鑒別診斷不同生物型的布魯氏菌感染。因此，我們設(shè)想在保留M5-90中BP26和OMP31蛋白的保護(hù)性抗原表位前提下，針對這兩蛋白抗原表位及毒力相關(guān)位點進(jìn)行分子修飾或改造，構(gòu)建分子標(biāo)記的弱毒疫苗株，提高布魯氏菌疫苗免疫保護(hù)效果，并建立表位Pepti

9、de-ELISA診斷方法解決免疫與野生菌株感染的鑒別診斷技術(shù)難題。
　　 目的:本研究旨在測定布菌M5-90疫苗弱毒株在免疫羊后的體液和細(xì)胞免疫保護(hù)應(yīng)答，揭示布菌M5-90弱菌毒株優(yōu)勢蛋白BP26和OMP31蛋白T和B細(xì)胞抗原表位，評估其與免疫保護(hù)效果相關(guān)性，最終繪制出M5-90主要蛋白抗原表位及其宿主MHC限制性圖譜，給弱毒疫苗株的基因工程改造提供實驗數(shù)據(jù)支持。
　　 方法:實驗采用試管凝集和虎紅平板凝集實驗和ELIS

10、A檢測M5-90疫苗菌免疫前0個月和免疫后0.5，1，2，2.5，7.5個月抗體的變化，以檢測免疫后體液免疫效果。采用IFN-γ的酶聯(lián)免疫斑點印跡檢測技術(shù)(ELISpot)，使用BP26和OMP31的重疊多肽刺激免疫前和免疫后0.5，1，2，2.5，7.5個月的羊PBMCs，檢測分泌IFN-γ的T細(xì)胞數(shù)量變化，以反映疫苗免疫后機(jī)體的細(xì)胞免疫保護(hù)應(yīng)答效果。根據(jù)免疫后進(jìn)行的IFN-γ酶聯(lián)免疫斑點印跡檢測結(jié)果，篩選能特異性刺激T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生I

11、FN-γ的多肽，即BP26或OMP31蛋白的T細(xì)胞表位。
　　 采用原核表達(dá)技術(shù)，制備M5-90菌株重組OMP31(rOMP31)蛋白。以rOMP31蛋白為抗原免疫BALB/c小鼠，采用鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備OMP31單克隆抗體。以M5-90菌株提取的含天然OMP31的膜蛋白(NMP)和菌體破碎上清為抗原，采用Western Blot和ELISA方法測定制備的單克隆抗體的特性;以合成的OMP31重疊多肽，采用Pept

12、ide-ELISA方法篩查和鑒定單克隆抗體識別的抗原表位。
　　 結(jié)果:
　　 1)疫苗免疫效果測定:實驗測定了M5-90疫苗株免疫后的美利奴羊和哈薩克羊的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。發(fā)現(xiàn)M5-90疫苗可以誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體，在疫苗接種后0.5個月的凝集(SAT)抗體達(dá)到高峰，隨之快速下降并對加強(qiáng)免疫無明顯反應(yīng);相反，針對外面蛋白的ELISA抗體長時間保持較高水平。細(xì)胞免疫應(yīng)答方面，M5-90疫苗接種能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫分泌特

13、異性INF-γ，部分強(qiáng)勢表位反應(yīng)性強(qiáng)，但總體水平低，持續(xù)時間短，可能與Treg細(xì)胞快速活化和增殖相關(guān)。
　　 2) BP26和OMP31蛋白T細(xì)胞表位篩查:利用重疊多肽的ELISpot實驗對BP26和OMP31的抗原T細(xì)胞表位進(jìn)行測定，篩選出19個反應(yīng)多肽(BP2610條，OMP319條)，其中含10個高頻率共同性或優(yōu)勢表位多肽，分別為BP26-06:42VTGEGMMTASPDMAIL57, P26-08:60SVLRQAKT

14、AREAMTAN75,P26-11:87KKAGIEDRDLQTGGIN102, P26-12:96LQTGGINIQPIYVYPD111和OMP31-09:69EQVSGSLDVTAGGFVG84, OMP31-14:114SISAGASGLEGKAETK129,OMP31-17:141GYTATERLMVYGTGGL156, OMP31-18:150VYGTGGLAYGKVKSAF165, OMP31-23:195INNNWTLKS

15、EYLYTDL210,OMP31-26:222FLESKVNFHTVRVGLN237。這些多肽可以誘導(dǎo)兩種不同品系免疫羊的T細(xì)胞反應(yīng)。
　　 篩選出5個品系特異性表位多肽，包括BP26-10:78AMTKVLDAMKKAGIED93, BP26-18:150LGVNQGGDLNLVNDNp174, BP26-21:177VANAIAKAKTLADAAG192, BP26-22:186TLADAAGVGLGRVVEI201和OMP

16、31-12:96NGVVLGAETDFQGSSV111。這些表位多肽誘導(dǎo)單一品系免疫羊產(chǎn)生特異性INF-γ分泌。
　　 篩選出4個低頻率的個體差異性表位多肽包括:BP26-15:123GYSVSTSLT VRVRELA138, BP26-23:195LGRVVEISELSRPPMp210, OMP31-06:42GGYIGINAGYAGGKFK57, OMP31-21:177WSDKTKAGWTLGAGAE192。這兩個表位多肽

17、誘導(dǎo)個別免疫羊產(chǎn)生T細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)。
　　 為了分析T細(xì)胞表位多肽與宿主遺傳免疫限制的相關(guān)性，實驗對11只免疫羊進(jìn)行了MHCⅠ等位基因全序列和MHCⅡ DRB1 exon2等位基因序列的多態(tài)性分析。
　　 3) OMP31蛋白B細(xì)胞表位篩查:以重組OMP31蛋白，制備了22株能夠識別羊布氏菌M5-90弱毒疫苗天然OMP31抗原的單克隆抗體，包括了11株IgG2a、5株IgG1和6株IgM三種亞型，識別線性，半構(gòu)象和構(gòu)象三種

18、B細(xì)胞抗原表位。新發(fā)現(xiàn)了5個B細(xì)胞線性表位，分別為OMP31-05:33APVDTFSWTGGYIGIN48, OMP31-11:87QAGYNWQLDNGVVLGA102, OMP31-20:168GDDASALHTWSDKTKA183, OMP31-21:177WSDKTKAGWTLGAGAE192, OMP31-24:204EYLYTDLGKRNLVDVD219。其中OMP31-21同為T細(xì)胞表位。
　　 4) BP26與

19、OMP31抗原T和B細(xì)胞表位簡圖:根據(jù)BP26與OMP31抗原對M5-90免疫羊T細(xì)胞或重組蛋白免疫小鼠B細(xì)胞的反應(yīng)，繪制了實驗室初步測定的T和B細(xì)胞表位簡圖并進(jìn)行了描述。
　　 結(jié)論:
　　 1) M5-90疫苗免疫羊產(chǎn)生的SAT抗體持續(xù)時間短，水平低，而ELISA抗體長時期保持高位。
　　 2) M5-90疫苗免疫可以誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)，在免疫后1個月達(dá)到高峰，隨之快速下降，總體水平較低，持續(xù)時間較短。

20、
　　 3) M5-90疫苗免疫同時誘導(dǎo)Treg細(xì)胞增殖，抑制保護(hù)性T細(xì)胞免疫反應(yīng)，可能是造成疫苗免疫保護(hù)效率低的原因之一。
　　 4)篩選出10個BP26和OMP31的高頻率共同性或優(yōu)勢表位多肽，5個品系特異性表位多肽和4個個體特異性表位多肽。
　　 5)分析了實驗羊MHCⅠ和MHCⅡ DRB1Exon2等位基因的多態(tài)性與T細(xì)胞表位多肽反應(yīng)的相關(guān)性。
　　 6)制備了22株OMP31抗原單克隆抗體，50