基于牛布魯菌外膜蛋白OMP19、OMP22和OMP28三種重組蛋白的ELISA檢測方法研究.pdf

1、布魯菌病(Brucellosis)作為一種在世界范圍內(nèi)危害嚴重的人畜共患病，具有重要的獸醫(yī)公共衛(wèi)生意義。為建立一種牛布魯菌病快速可靠的血清學(xué)檢測方法，本論文在對其三種外膜蛋白原核表達的基礎(chǔ)上進行了基于重組蛋白混合抗原的酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)研究，具體如下:
　　根據(jù)GenBank中登錄的編碼牛布魯菌外膜蛋白OMP19、OMP22、OMP28的基因序列，以布

2、魯菌A544株基因為模板，分別設(shè)計了3對特異性引物，利用PCR技術(shù)擴增目的基因片段。將目的基因分別克隆到pCold-TF原核表達載體系統(tǒng)中，經(jīng)PCR鑒定、酶切鑒定和測序鑒定正確后進行IPTG誘導(dǎo)重組蛋白的表達、重組蛋白的SDS-PAGE分析與Western blot鑒定，并利用親和層析技術(shù)對重組蛋白進行純化，結(jié)果成功擴增出534 bp、639 bp和753 bp的編碼牛布魯菌外膜蛋白OMP19、OMP22、OMP28的基因序列，并克隆到

3、pCold-TF原核表達載體構(gòu)建了3種蛋白基因的重組表達質(zhì)粒pCold-TF-OMP19、pCold-TF-OMP22和pCold-TF-OMP28。誘導(dǎo)表達的3種重組蛋白分別為69 kD、74 kD和80 kD，均為可溶性蛋白，Western blot顯示均有良好反應(yīng)原性。利用親和層析技術(shù)對三種重組蛋白進行純化，獲得了高純度的蛋白。
　　將三種重組蛋白按濃度比，等比例混合作為包被抗原，經(jīng)過優(yōu)化包被條件、封閉條件、反應(yīng)溫度和時間等

4、初步建立了牛布魯菌感染抗體檢測的間接酶聯(lián)免疫吸附方法(indirect ELISA，iELISA)，并進行了實驗室保存的300份臨床樣品檢測應(yīng)用，同時進行虎紅平板凝集實驗(RBPT)、同類進口商品化試劑(IDEXX)的平行檢測。結(jié)果顯示建立的iELISA方法，最佳的混合抗原濃度為(1∶1∶1)μg/ml，最適封閉液為10％馬血清，最適一抗稀釋度為1∶200，二抗稀釋度為1∶20000。該方法特異性良好，不與小腸結(jié)腸炎耶爾森菌診斷血清和大

5、腸桿菌診斷血清發(fā)生交叉反應(yīng)。300份臨床血清樣品檢測結(jié)果顯示虎紅平板凝集試驗(RBPT)檢測62份為陽性，238份為陰性;以RBPT檢測結(jié)果為標準，IDEXX試劑盒檢測62份陽性血清中60份為陽性（假陰性2份），敏感率為96.78％(60/62);238份陰性血清中236份為陰性（假陽性2份），特異率為99.16％(236/238)，總符合率為98.67％(296/300)?；旌峡乖璻OMPs-ELISA法檢測結(jié)果為，62份陽性血清中5