柑橘脫毒及柑橘黃龍病病原omp基因的克隆和蛋白特性研究.pdf

1、柑橘病毒病害以及病毒類似病害主要包括衰退病、碎葉病、黃龍病和裂皮病等，本課題主要以柑橘黃龍病，衰退病、碎葉病作為研究對(duì)象。由于病毒病害可通過(guò)昆蟲(chóng)媒介或者嫁接等方式進(jìn)行遠(yuǎn)距離，大范圍的傳播，已造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，而現(xiàn)階段缺少有效的防治方法。因此研究有效的脫毒方法和抗病毒試劑，并結(jié)合現(xiàn)代的分子檢測(cè)手段對(duì)柑橘病害進(jìn)行檢測(cè)和治療具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。在細(xì)菌中編碼一種膜外蛋白(OMPs)，被公認(rèn)為是研究種間和種內(nèi)變異的候選蛋白，OMPs在許多革蘭氏

2、陰性細(xì)菌致病機(jī)理中起著關(guān)鍵作用，它們參于細(xì)菌的適應(yīng)性反應(yīng)，同時(shí)因?yàn)榧?xì)菌的外膜極易被宿主的免疫系統(tǒng)識(shí)別為外源物質(zhì)，OMP蛋白具有制備為免疫疫苗的可能。本課題的研究目的是根據(jù)已公布的柑橘黃龍病菌的omp基因序列，對(duì)該基因進(jìn)行克隆和表達(dá)，得到純化的目的蛋白后，制備針對(duì)柑橘黃龍病菌的單克隆抗體。現(xiàn)階段已取得的研究進(jìn)展如下：
　　 1.對(duì)桃葉橙帶毒苗采用中藥制劑與隔熱間37℃恒溫?zé)崽幚?0 d(10.11.3-11.1.20)后，病毒濃度

3、降低。藥劑處理設(shè)為3組：ⅰ.穿心蓮單獨(dú)處理，2g/株；ⅱ.黃柏單獨(dú)處理，2g/株；ⅲ.黃柏與穿心蓮各1g/株結(jié)合處理。每5d根灌一次。繼續(xù)相同方法處理50 d(11.4.19-6.9)后，碎葉病檢出率為8.7%。
　　 2.帶毒黔陽(yáng)無(wú)核椪柑和福本臍橙在藥劑處理和變溫?zé)崽幚?39℃恒溫2d，35℃恒溫2d)結(jié)合處理50d(2011.10.18-12.7)后，能夠有效脫毒碎葉病，脫毒率為100%。而黔陽(yáng)無(wú)核椏柑的死亡率過(guò)高，存活率為

4、11.1%。
　　 3.對(duì)疑似帶黃龍病菌的柑橘樣葉以及長(zhǎng)春花樣葉進(jìn)行病原檢測(cè)，并利用提取的長(zhǎng)春花樣葉的DNA基因組成功克隆到omp基因，基因片段大小為2346bp。
　　 4.構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-22b-omp，但目的蛋白并無(wú)表達(dá)量，只觀察到截短蛋白的表達(dá)。對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，對(duì)其C端表面抗原區(qū)域的561-781aa進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)應(yīng)的序列片段命名為ompC。成功克隆該片段，構(gòu)建重組表達(dá)載體后，在表達(dá)菌株B