柑橘黃龍病菌及與其混合發(fā)生病毒的分子特性及超低溫脫除研究.pdf

1、柑橘黃龍病(Citrus Huanglongbing，HLB)是世界性柑橘生產(chǎn)上的毀滅性病害。易與其混合發(fā)生的幾種柑橘病毒病及類似病害主要包括衰退病、裂皮病和碎葉病；病原分別為Citrus tristeza virus(CTV)，Citrus exocortis viroid(CEVd)．Citrus tatter leaf virus(CTLV)。本研究主要以HLB病菌、CTV、CEVd、CTLV為對(duì)象，從生物學(xué)角度及分子水平上對(duì)其部

2、分特性進(jìn)行研究；目的是建立上述4種病原的高靈敏度的分子檢測(cè)技術(shù)體系；在分子水平上明確其部分分子特性。另外初步探討運(yùn)用超低溫技術(shù)脫除HLB病菌、CTV、CEVd的可能性及機(jī)理。主要獲得結(jié)果如下： 1．HLB病菌生物學(xué)鑒定及PCR檢測(cè)體系優(yōu)化。以長(zhǎng)春花和椏柑為指示植物，部分 待檢材料表現(xiàn)了明顯HLB癥狀。通過(guò)對(duì)影響PCR技術(shù)的各個(gè)主要因素的調(diào)整， 建立了HLB病菌PCR、Semi-Nested PCR及Nested-PCR檢測(cè)技

3、術(shù)；并對(duì)三種方 法的檢測(cè)靈敏度進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Semi-Nested PCR及Nested-PCR檢測(cè)靈敏 度遠(yuǎn)高于常規(guī)PCR，是常規(guī)PCR的10<'4>倍。運(yùn)用Nested-PCR技術(shù)在黃皮上檢測(cè) 出HLB病菌(Candidatus Liberobacter asiaticus)，在國(guó)內(nèi)外屬于首次報(bào)道。 2．不同引物檢測(cè)HLB病菌靈敏度比較。對(duì)基于rplA／rplK，β-operon，16SrDNA和 16S／23S

4、rDNA不同基因組序列設(shè)計(jì)的5對(duì)引物依次為fP400／rP400，fP535／rP535， fA2／rJ5，fOll／rOl2c，fOl2／r23S1檢測(cè)HLB病菌靈敏度進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不 同引物檢測(cè)靈敏度不一樣，其檢測(cè)靈敏度由高到低依次為：fP400／rP400>fP535／r P535>fA2／rJ5>fOll／rOl2c>fOI2／r23SI。 3．HLB菌亞洲株系分子鑒定。HLB病菌16SrDNA片段RFLP-

5、SSCP分析及基于 16SrDNA序列中國(guó)柑橘黃龍病菌屬分類地位的確立，分析結(jié)果顯示來(lái)自中國(guó)7省區(qū)9個(gè)代表性的分離物16SrDNA高度保守，全部屬于亞洲菌系(Candidatus Liberobacter asiaticus)。HLB病菌16S／23SrDNA間區(qū)序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 結(jié)果顯示：來(lái)自中國(guó)7省區(qū)分布在不同的寄主體內(nèi)、導(dǎo)致寄主表現(xiàn)不同癥狀的 18個(gè)分離物在該區(qū)段沒(méi)有發(fā)生顯著變異，各分離物之間的同源性達(dá)99％以上，

6、 全部與亞洲菌系(Candidatus Liberobacter asiaticus)高度同源，而與非洲菌系 (Candidatus Liberobacter africanum)差異較大。 4．HLB病菌Somhem blotting檢測(cè)。利用α-<'32>p-dCTP標(biāo)記16SrDNA探針進(jìn)行HLB 病菌Dot-blotting檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Dot-blotting檢測(cè)靈敏度高于常規(guī)PCR而低于 Semi-Neste

7、d PCR及Nested-PCR，最低檢測(cè)下限為30fg總核酸。 5．CTV生物學(xué)鑒定、RT-PCR檢測(cè)技術(shù)的建立及來(lái)自不同寄主的21個(gè)分離物3'端、 5’端分子特性分析。以墨西哥萊檬和甜橙為指示植物，待檢樣品表現(xiàn)典型的CTV 致病癥狀。核苷酸序列多重比對(duì)分析結(jié)果顯示：21個(gè)CTV分離物的5，端和3' 端共4個(gè)變異區(qū)(A區(qū)，F(xiàn)區(qū)，CP，P20)存在明顯的差異。A區(qū)的核苷酸序列相似性最低，為95.92％；F區(qū)的核苷酸序列相似

8、性最高，平均可達(dá)98.01％；CP，P20區(qū)的核苷酸序列相似性分別為97.20％，96.39％。21個(gè)分離物與GenBank中9個(gè)代表性的CTV分離物相應(yīng)區(qū)段的核苷酸序列平均相似性分別為84.21％，96.12％，96.25％，95.48％，說(shuō)明CTV分離物之間在A，F(xiàn)，CP，P20 4個(gè)區(qū)段核苷酸序列存在較大差異。 　 6．CEVd生物學(xué)鑒定及RT-PCR檢測(cè)技術(shù)建立。以Etrog香櫞為指示植物，待檢樣品表現(xiàn)典型的CEVd致

9、病癥狀。廣東、意大利、重慶中柑所分離物全長(zhǎng)cDNA克 隆及序列分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：6個(gè)CEVd分離物核苷酸序列相互之間具有明顯的差異，同源性介于95.1％-99.2％之間；重慶中柑所分離物ZGS-ZK與意大利分離物Italy-BL核苷酸序列同源性為98.4％，可初步劃歸為相近的株系；廣東分離物XNM-HJ與其它3個(gè)分離物核苷酸序列同源性差異在3％左右，因此極有可能為2個(gè)不同的株系。 7．CTLV生物學(xué)鑒定、RT-PCR檢測(cè)及3’端擴(kuò)

10、增克隆及序列分析。以Rusk枳橙作為指示植物，待檢樣品廣東沙糖桔CTLV-GD表現(xiàn)典型的CTLV致病癥狀。CTLV-GD 3’末端的分子特性分析結(jié)果顯示：該分離物3'末端核苷酸序列與日本來(lái)自百合的分離物D16681、Li-23(AB004063)同源性高達(dá)100％；通過(guò)對(duì)上述分離物以及GenBank中已發(fā)表序列的ORF2、V-區(qū)以及CP區(qū)進(jìn)行核苷酸及推導(dǎo)氨基酸序列的同源性比較，進(jìn)一步證實(shí)了我國(guó)CTLV-GD分離物與日本分離物高度同源；而

11、且與ASGV也具有一定的同源性，特別是ORF2區(qū)的氨基酸序列同源性高達(dá)93.5％。 8．建立了HLB病菌、CTV、CEVd一步法多重RT-PCR檢測(cè)體系。敏感性測(cè)驗(yàn)證明該體系能夠同步檢測(cè)到10pg總RNA中的HLB和CEVd病原，1pg總RNA中的CTV病毒，說(shuō)明該體系不失為一種高靈敏度的病原檢測(cè)方法。 9．HLB病菌、CTV、CEVd超低溫脫除技術(shù)體系初步建立及脫毒機(jī)理初探。通過(guò)對(duì)影響超低溫技術(shù)的各個(gè)因素的摸索，初步建