小反芻獸疫多表位疫苗抗原的設(shè)計(jì)及其免疫效力評(píng)價(jià).pdf

1、小反芻獸疫病毒(PPRV)屬于麻疹病毒屬（Morbillivirus），是引起山羊和綿羊等小反芻動(dòng)物急性傳染病的病原，該病特點(diǎn)是高發(fā)病率和高死亡率，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為法定報(bào)告動(dòng)物傳染病，我國(guó)將其列為Ⅰ類動(dòng)物疫病。最初，PPRV僅在山羊和綿羊上有報(bào)道，但近幾年病毒種間傳播的病例被不斷出現(xiàn)。盡管該病毒只有一個(gè)血清型，但有四個(gè)基因型(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)，具有區(qū)域性分布的特點(diǎn)，目前該病主要分布于非洲和亞洲，正威脅歐洲。HN和F蛋白是

2、鑲嵌在病毒囊膜上的糖蛋白，HN蛋白能夠與淋巴細(xì)胞上的SLAM受體相互作用介導(dǎo)病毒入侵，這可能是導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制的主要原因。在病毒侵入過程中，F(xiàn)蛋白能夠起到融合細(xì)胞膜和病毒囊膜的作用。另外，PPRV能引起機(jī)體強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，而HN和F蛋白則是主要的保護(hù)性抗原。本研究希望篩選出HN和F蛋白的B細(xì)胞抗原表位，進(jìn)而設(shè)計(jì)小反芻獸疫多表位疫苗候選抗原。利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的pET21 a-rPPRV-HN-F質(zhì)粒，經(jīng)過轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)表達(dá)和純化

3、獲得了rPPRV-HN-F蛋白;經(jīng)過反應(yīng)原性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)rPPRV-HN-F蛋白與羊源PPRV陽(yáng)性血清具有明顯的反應(yīng)原性，用該蛋白制備了與PPRV具有良好反應(yīng)原性的單克隆抗體和多克隆抗體。同時(shí)，提取了PPRVVeroE6細(xì)胞毒培養(yǎng)基中的糖蛋白(PPRV-Glycoprotein)，制備了小鼠多克隆抗體，經(jīng)過反應(yīng)原性和特異性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)效果良好。對(duì)China/Tib/07株和Nigeria75/1毒株HN蛋白與羊SLAM受體復(fù)合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬，

4、確定了相互作用的關(guān)鍵氨基酸。結(jié)合模擬的結(jié)構(gòu)，利用免疫信息學(xué)工具對(duì)HN和F蛋白的B細(xì)胞表位進(jìn)行了預(yù)測(cè)。將人工合成的表位肽包被在氨基化酶標(biāo)板上，用間接ELISA方法檢測(cè)了表位肽與PPRV特異性抗體的反應(yīng)原性，發(fā)現(xiàn)了一批共11條具有反應(yīng)原性的表位肽。將篩選的具有反應(yīng)原性的部分表位肽串聯(lián)，經(jīng)過生物合成獲得了一定純度的多表位抗原。免疫小鼠檢測(cè)了抗體水平和T淋巴細(xì)胞增殖情況，發(fā)現(xiàn)多表位抗原能使小鼠產(chǎn)生特異性的抗體。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CD3+CD4+