西尼羅病毒多表位疫苗研究.pdf

1、西尼羅病毒(West nile virus，WNV)屬蟲媒病毒科黃病毒屬，能引起人畜共患性疾病。1937年該病毒首次在烏干達(dá)西尼羅河地區(qū)一個(gè)發(fā)熱婦女的血液中分離到并因此得名。其后在非洲、中東、中亞和西歐等地區(qū)先后有西尼羅病毒感染的報(bào)道，涉及數(shù)十個(gè)國(guó)家和地區(qū)。上世紀(jì)90年代以來(lái)，爆發(fā)感染的地區(qū)明顯增加。1999年西尼羅病毒開始在美國(guó)紐約地區(qū)發(fā)生爆發(fā)性大流行，隨后向各地蔓延。據(jù)美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心報(bào)道，2004年美國(guó)共發(fā)生西尼羅病毒感染9

2、175人，其中有230人已死亡。到目前為止，針對(duì)西尼羅病毒感染仍無(wú)有效的治療方法，真正用于預(yù)防西尼羅病毒的疫苗主要為滅活疫苗，且僅限于在馬群中應(yīng)用。 表位(epitope)是抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)，又稱抗原決定簇(antigenic determinant)。它是T細(xì)胞抗原受體(T cell receptor，TCR)和B細(xì)胞抗原受體(B cell receptor，BCR)與抗體特異結(jié)合的基本單位。在免疫應(yīng)答中

3、，TCR和BCR所識(shí)別的抗原表位不同，分別被稱為T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位。作為理想的免疫原，抗原分子中應(yīng)同時(shí)包含目的抗原B細(xì)胞表位和自身或外源T細(xì)胞表位，才能誘導(dǎo)出高度特異性的體液及細(xì)胞免疫反應(yīng)，從體液免疫和細(xì)胞免疫水平起到預(yù)防或治療作用，賦予較廣泛的保護(hù)性。表位疫苗是近年來(lái)病毒新型疫苗研究的熱點(diǎn)。目前關(guān)于西尼羅病毒多表位疫苗的研究尚未見報(bào)道。 基于此，本研究在西尼羅病毒多表位疫苗方面進(jìn)行了探索性研究。在對(duì)西尼羅病毒全基因序列進(jìn)行

4、比對(duì)分析的基礎(chǔ)上，確定可能作為表位的基因序列，并通過(guò)串聯(lián)方式進(jìn)行連接得到多表位基因，同時(shí)對(duì)該序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化。利用原核表達(dá)載體系統(tǒng)，觀察多表位基因的表達(dá)情況及其重組蛋白在家兔體內(nèi)的免疫原性。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建含有西尼羅病毒多表位基因的真核重組質(zhì)粒DNA，并采用多種方式對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，觀察其誘導(dǎo)免疫應(yīng)答水平的能力和差異，為研制具有高免疫原性的西尼羅病毒多表位核酸疫苗提供依據(jù)。 首先，我們利用生物分析軟件對(duì)西尼羅病毒China 01

5、株全基因序列進(jìn)行分析，得出可作為抗原表位的不同基因序列，結(jié)合文獻(xiàn)確定目的基因(M)由4個(gè)表位序列(分別編碼C蛋白第98-106 AA，PrM蛋白第73.91.AA，E蛋白第307-332 AA，NS1蛋白第252-260 AA)和3個(gè)連接肽基因組成，共計(jì)210個(gè)堿基。分別采用原核表達(dá)常用密碼子和哺乳動(dòng)物偏好密碼子對(duì)該基因序列進(jìn)行優(yōu)化，使之適合于原核細(xì)胞和真核細(xì)胞表達(dá)。 其次，通過(guò)重疊PCR方法擴(kuò)增該基因片段，得到多表位基因cDN

6、A分子。將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到原核表達(dá)載體pET-43a(+)，獲得重組質(zhì)粒pET-43-M。將原核重組質(zhì)粒pET-43-M導(dǎo)入大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)的融合蛋白Nus-M經(jīng)SDS-PAGE電泳后進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pET-43-M可在原核細(xì)胞中大量表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物具有特異的西尼羅病毒抗原性。原核表達(dá)的Nus-M蛋白經(jīng)過(guò)純化、定量后，混合弗氏佐劑，采用多點(diǎn)皮下注射方式免疫白兔，免疫間隔為2周，共免疫3次，每次每只500μg。

7、應(yīng)用ELISA方法和間接免疫熒光法檢測(cè)抗體產(chǎn)生情況和效價(jià)。結(jié)果顯示，在第二次免疫后，兔體內(nèi)已經(jīng)產(chǎn)生針對(duì)Nus-M蛋白的抗體，在第三次免疫后達(dá)到高峰，以后逐漸下降。免疫結(jié)果顯示，重組蛋白能誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的高效價(jià)抗體。 第三，利用真核表達(dá)載體pcDNA3.1構(gòu)建西尼羅病毒真核重組質(zhì)粒pcDNA-M。將重組質(zhì)粒pcDNA-M轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞，采用RT-PCR方法檢測(cè)到重組質(zhì)粒在真核細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄，間接免疫熒光法在細(xì)胞胞漿中檢測(cè)到西尼羅病

8、毒的特異蛋白抗原，表明真核重組質(zhì)?？稍谡婧思?xì)胞內(nèi)表達(dá)，并且表達(dá)產(chǎn)物具有西尼羅病毒抗原性。 第四，進(jìn)一步觀察西尼羅病毒多表位基因重組質(zhì)粒DNA的免疫反應(yīng)性，同時(shí)比較重組質(zhì)粒DNA免疫、初始DNA免疫加重組蛋白加強(qiáng)和DNA加佐劑免疫等不同免疫方式誘導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng)的差異。結(jié)果顯示，三種免疫方案均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對(duì)西尼羅病毒的特異性中和抗體，中和抗體效價(jià)分別達(dá)到1:52、1:85和1:90．重組蛋白加強(qiáng)和免疫佐劑均能有效提高重組質(zhì)粒誘導(dǎo)

9、體液免疫應(yīng)答反應(yīng)。進(jìn)一步分析細(xì)胞免疫反應(yīng)證實(shí)，重組質(zhì)粒DNA組、初始DNA免疫加重組蛋白加強(qiáng)組和加免疫佐劑組均能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫，各組小鼠脾細(xì)胞經(jīng)過(guò)CoA刺激后，其特異性CTL殺傷率分別達(dá)到18.9％(E/T=20/1)、32.1％(E/T=20/1)并1:147.7％(E/T=20/1)，刺激指數(shù)分別為4.10±1.34、3.80±0．12和7.81±0.13，明顯高于對(duì)照組。 第五，病毒攻擊觀察重組西尼羅病毒多表

10、位基因疫苗的免疫保護(hù)作用。取經(jīng)不同免疫途徑免疫后的BALB/C小鼠，分別在每只小鼠顱內(nèi)注射100 LD<,50>的西尼羅病毒懸液，然后連續(xù)觀察2周，統(tǒng)計(jì)各組死亡數(shù)并計(jì)算保護(hù)率。結(jié)果顯示，初始DNA免疫加重組蛋白加強(qiáng)組和IDNA加佐劑組保護(hù)率高，達(dá)到62.5％，重組質(zhì)粒DNA組保護(hù)率為50％，而單純采用重組融合蛋白免疫組保護(hù)率最低，只有25％。這些結(jié)果表明，重組的西尼羅多表位基因疫苗對(duì)防止西尼羅病毒感染具有較好的保護(hù)作用。 本研究