西尼羅病毒免疫診斷方法的建立及對入境人員的血清調(diào)查.pdf

1、目的:利用哺乳動物細(xì)胞293T細(xì)胞表達(dá)含有西尼羅病毒(WNV)PrM-E的蛋白，自我組裝成病毒樣顆粒(virus-like particles，VLPs)，改進(jìn)優(yōu)化轉(zhuǎn)染等條件實現(xiàn)大規(guī)模轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，獲得大量的純化蛋白，以此蛋白作為抗原研制檢測西尼羅病毒抗體的ELISA試劑盒，用試劑盒來實現(xiàn)對我國出入境人員的血清進(jìn)行調(diào)查。
　　方法:篩選典型西尼羅病毒株，構(gòu)建重組質(zhì)粒，大規(guī)模轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，優(yōu)化轉(zhuǎn)染的條件和方法，表達(dá)西尼羅病毒

2、prM-E蛋白，獲得大量的表達(dá)重組蛋白，通過間接免疫熒光實驗驗證表達(dá)抗原的完整性和特異性，純化西尼羅病毒prM-E蛋白抗原，ELISA對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定制成大規(guī)模的檢測試劑盒;采用蔗糖梯度離心10-60％結(jié)合超速離心純化表達(dá)產(chǎn)物;將純化的表達(dá)產(chǎn)物包被子聚苯乙烯微量反應(yīng)板，與待檢血清中抗WNV抗體反應(yīng)后，經(jīng)洗滌，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗人IgG與之結(jié)合，然后用TMB作用顯色，建立間接ELISA方法，評價建立的間接ELISA方法對我國入

3、境人員血清進(jìn)行檢測。
　　結(jié)果:重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后產(chǎn)生病毒樣顆粒(viruslike particles VLPs)，優(yōu)化轉(zhuǎn)染的條件和方法，從轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞從細(xì)胞的上清液中和細(xì)胞中的表達(dá)的蛋白的的純化物中獲得大規(guī)模的重組蛋白，通過間接免疫熒光試驗表明，表達(dá)的病毒樣顆粒蛋白具有良好的抗原性;間接ELISA證實，重組蛋白可以作為抗原用于檢測患者血清特異性抗體;純化得到的大量的蛋白包被成ELISA試劑盒，通過對來自西尼羅疫區(qū)的286

4、份我國入境人員血清檢測，與金標(biāo)準(zhǔn)美國FOCUS的WNV IgG檢測試劑盒比較，ELISA-Lab陽性檢出率為35.6％，F(xiàn)OCUSWNVIgG檢測試劑盒則為32.5％，兩者之間無統(tǒng)計學(xué)差異(X2=3.05，P=0.078＞0.05),Kappa值為0.8372，兩者具有良好的一致性，其中兩者的陽性檢出符合率為91.18％，陰性符合率為95.34％，總符合率為92.66％。
　　結(jié)論:在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的西尼羅病毒樣顆粒具有良好的