穩(wěn)定表達西尼羅病毒prM-E蛋白細胞系的構(gòu)建.pdf

1、西尼羅病毒(West Nile Virus，WNV)屬黃病毒科，黃病毒屬，是一種重要的人獸共患傳染病病毒。多種鳥類和哺乳動物對該病毒易感，其中馬受WNV的危害最為嚴重。人感染該病毒后可導(dǎo)致西尼羅熱，嚴重者出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，甚至可致死亡。該病毒對養(yǎng)殖業(yè)和人類健康都構(gòu)成了巨大威脅。WNV尚無特異性的治療方法，疫苗免疫接種是控制該病的主要措施。
　　目前國外已經(jīng)報道了幾種獸用WNV疫苗，我國尚且沒有可用的WNV疫苗。傳統(tǒng)減毒活疫苗和

2、滅活疫苗免疫原性比較好，但仍存在缺陷，如滅活苗免產(chǎn)生疫應(yīng)答較慢，只能誘導(dǎo)低水平體液免疫，弱毒疫苗具有有潛在性安全問題等，因此研究者們致力于研發(fā)更為安全有效的新型疫苗。
　　研究表明WNV prM-E蛋白能夠在哺乳動物細胞中表達，并自我組裝成病毒樣顆粒(VLPs)。該病毒樣顆粒與天然的病毒顆粒在誘導(dǎo)機體免疫應(yīng)答方面有著相似的能力。本實驗室在之前的研究中已經(jīng)利用哺乳動物表達系統(tǒng)成功表達了流行性乙型腦炎病毒(JEV)病毒樣顆粒。因此，本

3、實驗擬構(gòu)建一個能夠持續(xù)穩(wěn)定表達WNV VLPs的真核細胞系，為后續(xù)制備WNV亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　為鑒定細胞系表達目的蛋白情況，本實驗制備并篩選了一株WNV prM蛋白特異性單克隆抗體。該單抗細胞上清和腹水ELISA效價分別為1∶2048和1∶409600以上;單抗亞型鑒定結(jié)果表明10F7屬于IgG2a，其輕鏈類型為κ鏈;Western blot和IPMA結(jié)果顯示，該單抗與WNV prM特異性反應(yīng)，與JEV無交叉反應(yīng)。

4、　　將編碼WNV prM蛋白和E蛋白基因的重組質(zhì)粒pCAG-opti-WNV-prME轉(zhuǎn)染進BHK-21細胞，然后用含有G418的選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)多次亞克隆并結(jié)合間接免疫熒光(IFA)和抗原捕獲ELISA方法篩選，最終得到一個能夠穩(wěn)定表達WNV prM-E蛋白的細胞系W-92。IFA和流式細胞術(shù)試驗結(jié)果表明該細胞系持續(xù)到第30代仍然保持高水平的蛋白表達。對W-92細胞系表達產(chǎn)物分離純化后電鏡觀察，結(jié)果表明prM蛋白可與E蛋白組裝成病

5、毒樣顆粒。將該病毒樣顆粒抗原免疫小鼠后，可檢測到較高效價的ELISA抗體;誘導(dǎo)的抗體具有病毒中和作用，對WNV的中和抗體效價為1∶40，對JEV的中和效價介于1∶20～1∶80，有一定程度的交叉保護作用。將純化后的VLPs免疫鵝后，其血清的JEV中和效價介:1∶20～1∶40之間。在使用JEV病毒P3株對小鼠致死性病毒攻擊試驗中，免疫小鼠保護率為50％-70％。
　　本實驗構(gòu)建了一株能持續(xù)穩(wěn)定表達WNV prM-E蛋白的真核細胞系