1、EstablishimentofVero—E6CellLineStablyEXpressingCanineDisteInperVimsReceptorNectin一4Thesissubmittedto如D內(nèi)砒“厲配紀(jì)廠訓(xùn)佗覘疵砂InFumⅡmentoftheRequirementfortheDegreeofMaSterOfAgrOnOmyV，YhZekunCoⅡegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicin
2、eSuperVisor：Pro￡ShaⅡHuQingdaoChinaJune2014青島農(nóng)業(yè)大學(xué)碩：上學(xué)位論文摘要摘要由于犬瘟熱病毒為單股負鏈的RNA病毒，在自然環(huán)境中不易存活，需要在傳代細胞中增殖以實現(xiàn)長期保存并達到人工制弱及制備疫苗的目的。但常規(guī)傳代細胞不具有介導(dǎo)犬瘟熱病毒侵染的特異性受體，表現(xiàn)出對犬瘟熱病毒的不敏感，需要將細胞改造使其表達感染受體以增加對犬瘟熱病毒的敏感性。本次試驗通過克隆犬瘟熱病毒受體Nectin4，在ver0E
3、6細胞中表達獲得了穩(wěn)定細胞系，為犬瘟熱病毒的進一步分離打下了基礎(chǔ)。為了解分析Bealge犬Nectin一4分子基因和氨基酸序列的同源性及種間保守性，試驗一根據(jù)Genebank登陸的已有物種Nectin4序列設(shè)計引物，通過RT_PcR方法從雌性比格犬胎盤和肺組織中成功獲得比格犬Nectin4全序列cDNA并對其進行了分析。結(jié)果顯示：Nectn4分子開放閱讀框為1530bp，編碼509個氨基酸，為典型的免疫球蛋白超家族VCC結(jié)構(gòu)。經(jīng)比對分析
4、比格犬Nectin4與已公布的拉布拉多犬序列同源性為99％，物種間保守性均高于90％，且犬瘟熱病毒結(jié)合位點高度保守。將Nectin一4基因片段上下游引物5’端分別引入EcoRI酶切位點、Kozak序列及FIag標(biāo)簽、SaII酶切住點，通過EcoRI、SalI雙酶切方法獲得相同的粘性末端并使用T4連接酶引入pⅡ汪S2EGFP真核表達載體中，使用5倍體積Lipfectamine蹦2000將重組質(zhì)柱瞬時轉(zhuǎn)染至veroE6細胞中，通過增強型熒光
5、蛋白、間接免疫熒光方法及RT_PCR方法確定蛋白成功表達，Westemblot試驗獲得約為56kDa的目的蛋白條帶，對Vero—E6細胞多組分分別染色，確定目的蛋白在信號肽的引導(dǎo)作用下可以自然定位于細胞膜表面，可用于病毒侵染分離。vero—E6細胞分別使用100肛∥mIlloo陷／ml建立G418濃度梯度，選定600鵬／ml為最終工作篩選濃度。通過有限稀釋法將篩選陽性細胞單克隆化至96孔板，并進行鑒定培養(yǎng)，篩選表達Nectin4蛋白的細
