Wnt10b-DKK1-Gsdma3在毛囊周期中調(diào)控毛囊大小的作用與機制研究.pdf

1、根據(jù)形態(tài)學和細胞水平及分子水平上的行為的不同，毛囊的周期可以分為三個不同的階段：生長期(Anagen)、退化期(Catagen)以及靜止期(Telogen)[1-4]。毛囊在一個周期的不同時期中，體現(xiàn)著其特定的大小，包括不同的直徑和長度。毛囊在生長發(fā)育過程中如何決定其直徑和長度目前還不清楚。
　　毛囊的直徑受控于DP的大小。我們推測Wnt10b/DKK1可能通過調(diào)節(jié)DP與表皮細胞的相互作用來調(diào)節(jié)毛囊的直徑。本研究中，我們首先通過對

2、靜止期不應期（refractory telogen）的C57BL/6小鼠背皮多次過表達腺病毒介導的Wnt10b，激活經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路。通過H&E染色，檢測再生毛囊的形態(tài)變化。對過表達Wnt10b后的再生毛囊的種類進行分析，觀察Wnt10b對于再生毛囊種類改變的影響。為探討Wnt10b如何在細胞和分子水平上改變再生毛囊的形態(tài)，我們用免疫熒光檢測和比較了再生毛囊其干細胞、增殖、分化水平的變化。其次，我們在過表達Wnt1

3、0b后，繼續(xù)過表達DKK1，檢測DKK1對Wnt信號通路抑制之后，毛囊大小的變化情況。再次，我們對小鼠背皮生長期毛囊直接過表達DKK1，檢測其對毛囊大小控制的直接作用。
　　毛囊的長度決定于生長期的長短。此外，先前的研究表明，Gsdma3可能影響毛囊的生長發(fā)育。我們推測Gsdma3可能影響毛囊的長度。我們檢測了Gsdma3基因突小鼠背皮毛囊的形態(tài)，以及Gsdma3基因突變后Wnt/β-catenin的表達情況，以探討Gsdma3與

4、毛囊Wnt信號通路相互作用。再次，我們用TUNEL染色和免疫熒光、RT-PCR、Western blot等技術檢測凋亡信號通路的關鍵分子Caspase-3的表達，來觀察Gsdma3對毛囊內(nèi)外根鞘凋亡的影響。我們通過對野生型小鼠和Gsdma3基因突變鼠過表達Gsdma3，來確認Gsdma3對于毛囊形態(tài)學的控制。在離體水平上，我們對JB6細胞過表達Gsdma3，觀察Gsdma3對表皮細胞凋亡的影響。
　　過度的Wnt激活誘使新的毛囊的

5、生長。我們推測Wnt10b/DKK1參與新生物的生長發(fā)育。我們在離體水平上，對 JB6細胞持續(xù)過表達 Wnt10b或者連續(xù)性表達Wnt10b/DKK1，觀察皮膚細胞的遷移，增殖和侵襲能力的變化，在細胞和分子水平上鑒定Wnt10b/DKK1對于表皮細胞轉(zhuǎn)化過程中的作用。
　　主要結(jié)果如下：
　　① Wnt10b/DKK1調(diào)控毛囊的直徑：
　　檢測了4次Wnt10b過表達后，小鼠再生毛囊的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。在多次過表達Wnt1

6、0b誘導再生的毛囊中，其各部分結(jié)構(gòu)明顯增寬增粗，如毛球部、內(nèi)外根鞘、毛干髓質(zhì)等毛囊的結(jié)構(gòu)都明顯增寬，而毛乳頭也明顯增大，這些結(jié)構(gòu)的增大增寬共同導致了整個毛囊結(jié)構(gòu)的增寬，說明Wnt10b在毛囊再生過程中對毛囊直徑具有調(diào)節(jié)作用。Wnt10b誘導再生的毛囊，其長度沒有明顯變化。有趣的是，在影響的毛囊類型中，Wnt10b更多的作用于Zigzag毛囊，而對其他種類的毛囊作用較小，也并未顯著改變毛囊的種類。檢測了再生毛囊的增殖、分化情況和毛囊干細胞

7、的定位。在Wnt10b多次誘導再生的毛囊，Wnt信號通路過度激活，其各部分的增殖明顯加劇，內(nèi)根鞘和毛干的分化紊亂，而毛囊干細胞的標記物高表達于非bulge區(qū)的外根鞘部位。在2次過表達Wnt10b之后繼續(xù)過表達DKK1，大部分的毛囊可維持正毛囊常P98的大小，其毛母質(zhì)、外根鞘、DP的增殖能力恢復到正常水平，而外根鞘的毛囊干細胞標記物表現(xiàn)明顯降低，但其內(nèi)根鞘和毛干的分化水平無法完全恢復。一次劑量DKK1處理生長期早期毛囊，可顯著減小次級毛囊

8、毛干的直徑。
　　② Gsdma3調(diào)控毛囊的長度：
　　H&E染色顯示，Gsdma3基因突變鼠的毛囊間表皮和毛囊漏斗部明顯增厚，毛囊的長度在生長期稍顯增長但與野生型小鼠毛囊相比無顯著差異。但在野生型小鼠進入退化期毛囊長度縮短時，Gsdma3基因突變鼠的毛囊依舊維持生長期的長度。免疫熒光、RT-PCR和Western blot結(jié)果表明，β-catenin在Gsdma3基因突變鼠毛囊間表皮和漏斗部表達明顯升高，而Caspase-

9、3在Gsdma3基因突變鼠的內(nèi)外根鞘表達明顯降低。TUNEL染色顯示在毛囊退化期，Gsdma3基因突變鼠的內(nèi)外根鞘細胞凋亡程度明顯下降。TNF-a誘導C57BL/6鼠和Gsdma3突變鼠后，TNFR2和Gsdma3表達明顯升高，而凋亡跡象僅在B6鼠發(fā)生，在Gsdma3突變鼠受阻。在對 Gsdma3基因突變鼠和野生型小鼠背皮過表達 Gsdma3后，毛囊長度明顯縮短，內(nèi)外根鞘TUNEL陽性細胞數(shù)目明顯增加，Caspase-3表達明顯升高。在

10、離體水平上對JB6細胞過表達Gsdma3后，亦印證了在體水平Gsdma3促進上皮細胞凋亡的作用。
　?、?Wnt10b/DKK1控制表皮細胞轉(zhuǎn)型：
　　通過對JB6細胞2次過表達Wnt10b，經(jīng)典Wnt信號激活，細胞的增殖、遷移和侵襲能力明顯增加。在多次過表達Wnt10b后，JB6細胞轉(zhuǎn)化為細胞團的形態(tài)結(jié)構(gòu)。而順序性過表達Wnt10b+DKK1，可阻斷Wnt信號通路的激活，并抑制細胞的增殖、遷移和侵襲能力，阻止表皮細胞的轉(zhuǎn)化